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宫颈细胞中hpv16e6基因的荧光定量检测 宫颈是发展中国家女性最常见的肿瘤。高危型的人乳头瘤病毒(HPV),特别是HPV16型被认为是该肿瘤的主要病因。HPV16基因组主要由早期基因区(E区)、晚期基因区(L区)和长控制区(LCR)组成,E区有6个开放读码结构(ORF),即E1、E2、E4、E5、E6及E7,其中与转化有关的为E6和E7基因。HPV致癌的关键是转化蛋白E6、E7与细胞癌基因和抑癌基因相互作用。E6蛋白独立致癌性日益受到重视。而新疆妇女宫颈癌组织中HPV16 E6(新疆株)(AF327851)与德国标准株相比发生了碱基突变和相应的氨基酸序列改变,其可能成为新疆妇女宫颈癌高发的主要诱因。 为此,我们对新疆妇女宫颈癌、宫颈上皮内瘤变(CIN)、疑似宫颈癌而病理结果为炎症(宫颈炎)的蜡块组织及甲醛浸泡的宫颈癌组织提取的DNA并检测了其中HPV16E6基因;另外对一批妇科门诊患者随机取宫颈管的脱落细胞及分泌物作为对照,初步了解新疆妇女HPV的感染状况。采用荧光定量聚合酶链(FQ-PCR)方法,对上述5组不同患者的宫颈组织细胞进行了HPV16E6检测,同时设立细胞内参照β-肌动蛋白,利用荧光标记的探针对扩增的目的基因进行即时杂交,测定其荧光强度并与细胞内参照的荧光强度进行比较,从而达到对目的基因进行量化分析的目的,使该研究方法能够在未来用于宫颈癌的早期筛查,指导临床治疗,监测病情变化,并可能应用于该病的风险评估和放疗的疗效观察。 对象和方法 一、 因妊娠和宫颈炎而产生的各组 宫颈脱落细胞标本随机采自新疆医科大学第一附属医院妇科门诊患者,由医生在无菌操作下用棉拭子刷取宫颈脱落细胞,并置于无菌生理盐水中,充分震荡洗涤,密封送检。宫颈脱落细胞组共96例,其中汉族78例,维吾尔族16例,哈萨克族2例。宫颈癌、宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈炎蜡块组织由新疆医科大学第一附属医院病理科提供,共157例: 蜡块组织中宫颈癌59例,其中维吾尔族45例,汉族13例,柯尔克孜族1例。CIN组共65例,其中汉族41例,维吾尔族22例,哈萨克族2例。 宫颈炎组共33例均为维吾尔族。切取8 μm厚石蜡切片3片,放入高温灭菌的离心管中室温保存待用。另有10例的宫颈癌标本来自新疆喀什,均为维吾尔族。 二、 方法 1. 探针及引物合成 根据已注册的HPV16E6基因序列(GenBank AF327851),利用DNAMAN软件设计如下引物序列:上游引物5′CACAGGAGCGACCCAGAAA3′和下游引物5′GACATACATCGACCGGTCCAC3′,扩增片段长约400 bp,根据扩增片段的序列,利用英国premier公司的Beacon Designer软件设计探针序列: 5′(FAM)ACCACAGTTATGCACAGAGCT GC(TAMRA)3′;引物及探针分别由日本TaKaRa公司和加拿大Sangon公司合成。细胞内参照β-肌动蛋白基因引物、探针,取自美国Perkin Elmer(PE) Applied Biosystems公司 的β-肌动蛋白 Control reagents kit。 dNTP,Taq酶购自日本TaKaRa(大连)公司。 DNA模板提取所用试剂(包括蛋白酶K) 购自加拿大Sangon公司。 2. 仪器 主要为美国Perkin Elmer(PE)公司的5700荧光定量PCR仪。 3. 因子检测细胞dna 宫颈脱落细胞标本DNA提取方法按照中山大学达安基因诊断中心的FQ-PCR试剂盒操作规程进行,DNA提取液由该中心提供。得到的宫颈脱落细胞DNA溶液在-20℃冷藏备用。甲醛溶液浸泡的宫颈癌组织DNA的提取方法,在徐来祥等方法的基础上进一步优化改进。石蜡包埋组织DNA提取,首先用二甲苯对组织切片脱蜡,使细胞与消化液充分接触,保证了组织的完全破碎,DNA释放和蛋白去除更加完全。 4. pcr检测pucm-t、pv136的荧光强度与获得力 β-肌动蛋白标准梯度由试剂盒给定。HPV16E6标准梯度按如下方法建立:将本实验室的pUCm-T/HPV16E6提取纯化后用TE 缓冲液[10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA (pH 8.0)]稀释成103~107copy/μl,经定量PCR检测其荧光强度与拷贝数的线性关系后确定。 5. 目的基因片段的扩增 总体积50 μl,内含dNTPs200 μmol/L,上下游引物各 0.8 μmol/L,TaqDNA聚合酶0.5U,探针6 pmol,缓冲液(25℃ pH 9.0的10 mmol/L Tris HCI ,50 mmol/LKCI,0.1%Triton×100)及MgCl2浓度值的确定按析因实验方案进行。反应缓冲液配制好后,分两管分别加入HPV16E6和β-肌动