基因工程原理 动物细胞的基因转移.pptVIP

* 本文档共41页；当前第31页；编辑于星期二\12点23分 BPV载体 * 本文档共41页；当前第32页；编辑于星期二\12点23分 EBP载体 * 本文档共41页；当前第33页；编辑于星期二\12点23分 腺病毒 DNA病毒，基因组大约36kb 6个早期转录子，1个主要的后期转录子 稳定性、外源DNA高容量、宿主范围广、高滴度后代 * 本文档共41页；当前第34页；编辑于星期二\12点23分 腺病毒相关载体 AAV 单链DNA病毒 对异源辅助病毒有依赖性 AAV载体已用于将基因高效转入许多类型的细胞 * 本文档共41页；当前第35页；编辑于星期二\12点23分 杆状病毒 杆状病毒具有杆状的衣壳和大的dsDNA基因组 感染许多节肢动物，特别是昆虫。 主要用于在昆虫和昆虫细胞内的高水平瞬时蛋白表达 AcMNPV和BmNPV sf9，sf21 家蚕活体 * 本文档共41页；当前第36页；编辑于星期二\12点23分 * 本文档共41页；当前第37页；编辑于星期二\12点23分 * 本文档共41页；当前第38页；编辑于星期二\12点23分 * 本文档共41页；当前第39页；编辑于星期二\12点23分 动物细胞中高水平表达外源基因的载体设计 强组成型启动子的使用 包含内含子 包含poly A 去掉冗余的非翻译序列 提高外源基因翻译效率 整合一个靶信号 * 本文档共41页；当前第40页；编辑于星期二\12点23分 * 本文档共41页；当前第41页；编辑于星期二\12点23分 动物细胞利于生产重组动物蛋白，因为动物细胞可以进行细菌和真菌所无法进行的真正的翻译后修饰。 本章集中阐述了体细胞的DNA转入。与植物的情况不同的是，大多数动物细胞在发育能力上都受到限制，因此不能用于产生转基因动物。小鼠胚胎干细胞(ES细胞)在这方面是个例外，因为它们取自种系形成之前的早期胚。 * Szybalska和Szybalski(1962）用末克隆的总基因组DNA转染了次黄膘吟—鳥漂吟转磷酸核糖苷酶(HPRT)缺陷型的人细胞。通过在HAT培养基上进行筛选，获得了少数几个HPRT—阳性充隆,后来人们明白DNA转移的成功依赖于形成了良好的DNA／磷酸钙共沉淀．这种复合物先积累到细胞膜上，然后再由细胞摄取到内部。沉淀物必须在转染的时候临时制备。人们认为结合了DNA的磷酸钙颗粒通过胞吞作用而由细胞摄取并转运到细胞核，在那里一些DNA释放出来并得到表达。现在，这项技术巳成为对普通的培养细胞类型进行DNA转化的常规技术。但是,由于沉淀物必须包裹细胞，所以这项技术只适用于单层生长的细胞，而不适用于悬浮生长或成团生长的细胞。 * 这种方法使用了二乙氨乙基葡聚糖(DEA E—dextran)，它是一种可溶性聚阳离子糖类，可以促进DNA与细胞胞饮机制之间的相互作用。其后人们通过添加后处理步骤提高了最初方法的效率，比如渗压震扰或添加氯哇，事实证明后者可以抑制核内体泡囊的酸化作用.尽管对于许多细胞类型的瞬时转染都有很高的效率，但是DKAE－dextran仍不能用于形成稳定转化的细胞系。 * 不同于化学转染的另外一种方法是将DNA包装到一个磷脂泡囊中，泡囊可以和靶细胞的细胞膜作用并促进DNA摄取。简要地讲，用合适的质粒载体转化细菌細胞．再用氯霉素处理细胞以扩增质粒的拷贝数—用溶箘酶去掉细胞壁，再把得到的原生质体和哺乳动物细胞低速离心，使原生质体附着在的动物细胞的单层膜上，最后用聚乙一醇诱导融合．这种方法获得的转化体数量非常多，但是这种方法工作量太大，难以广泛应用.优点是温和．大的DNA片段可以在不发生剪切的情况下进行转移。更普遍使用的是人工磷脂泡囊(脂质体)。 * 脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层,又称为人工生物膜.最初,人们只是运用脂质体模拟生物膜,研究膜的构造及功能,从而发现了膜的融合及内吞作用,因而可用作外源物质进入细胞的载体.相对于电穿孔法和磷酸钙共沉淀转染法,脂质体介导转染法简便易行,成本适中,具有较高的转染率和较小的细胞毒性. * 电穿孔是将细胞置于短暂的电脉冲中使细胞膜上形成瞬时的纳米大小的孔。DNA通过这些孔进入细胞并转运到核。电穿孔技术已用于许多其他类型的细胞，最关键的参数是lk脉冲的强度和持续时间，这对于不同细胞必须通过实践来确定.但是，一旦把电穿孔的最佳参数确定下来，该方法就很容易进行，而且具有高重复性。这项技术需要高投入，因为需要一个专用的电容放电装置来精确控制脉冲长度和幅度。另外，和其他方法相比，这种方法需要的细胞量比较大，因为在大多数情况下，在点穿孔效率达到最高时细胞的死亡率会高达50％ * 日前，美国西北大学（Northwestern University