固相萃取-高效液相色谱法测定儿童尿液中邻苯二甲酸单酯.docxVIP

固相萃取-高效液相色谱法测定儿童尿液中邻苯二甲酸单酯 二甲酸酯，也被称为塑料剂，是一种广泛用于合成的化学品。它主要用于工业、药物和消费品，也用作溶剂和塑料制品的原料增剂。邻苯二甲酸二 (2-乙基己基) 酯 (DEHP) 、邻苯二甲酸丁基苄基酯 (BBzP) 主要用于增加PVC地板、医药管材和食品包装材料等塑料制品的可塑性, 而邻苯二甲酸二正丁酯 ( (DBP) 、邻苯二甲酸二乙酯 (DEP) , 则主要用于个人洗护产品 (如香水、洗涤剂、化妆品等) , 作为醋酸纤维素材料的溶剂或增塑剂, 还可用于生产罐头包装涂料、油漆和生产具有缓释作用的药物包衣。通常人们通过饮食、呼吸、皮肤接触和静脉注射等途径摄入邻苯二甲酸酯。邻苯二甲酸酯进入人体后, 由于其生物半衰期较短, 会迅速代谢并随尿液或粪便排出体外。邻苯二甲酸酯在人体中的代谢分为2个阶段:首先相对极性和分子量较低的邻苯二甲酸酯 (如DBP) 主要通过水解一个酯基代谢为对应的水解单酯 (MBP) , 而高分子量的邻苯二甲酸酯 (如DEHP) 则进一步代谢生成对应的氧化单酯, 部分水解单酯和氧化单酯随尿液或粪便排出, 另一部分单酯则通过进一步的生物转化形成水溶性更强的葡糖甘酸结合物。 邻苯二甲酸酯是一类内分泌干扰物, 对人类可能具有生殖和发育毒性, 导致哮喘和过敏发病率增加及甲状腺毒性、肝脏毒性和急性刺激效应。邻苯二甲酸酯代谢物与人体体重指数和腰围呈正相关, 可能增加女性患糖尿病的几率, 已有研究表明DEHP与其代谢产物MEHP降低了雌二醇、睾丸酮等固醇类激素的生物合成, 流行病学研究表明MBP、MBzP和MEHP会影响儿童控制甲状腺激素合成基因的表达, 因此关于人体邻苯二甲酸酯暴露水平的研究引起了广泛关注, 而DBP、BBzP和DEHP作为应用广泛、毒性较大的几种邻苯二甲酸酯更是研究的重点。由于邻苯二甲酸酯广泛存在于环境中, 取样污染很难避免, 导致人体暴露水平远低于取样带来的污染, 而测定邻苯二甲酸酯进入体内后的代谢产物邻苯二甲酸单酯可将取样带来的污染最小化, 邻苯二甲酸单酯可在多种生物样本 (如尿液、母乳、唾液、血清等) 中检测到。已有研究表明, 邻苯二甲酸单酯在人体体液中的检出量是尿液血清母乳和唾液, 因此本研究取尿样进行检测。 本文对尿液中邻苯二甲酸单酯的检测法进行优化, 采用Waters OASIS HLB固相萃取柱, 其中填料是水可浸润性反相吸附剂且适用的洗脱液pH范围较宽, 具有良好的重现性与稳定性, 其中3mL/60mg的SPE柱 (Solid Phase Extraction) 作用是保留在碱性条件下疏水的物质, 同时尽可能多的洗脱尿液样品中的酸性物质, 6mL/200mg的SPE柱的作用是将尿液样品中的邻苯二甲酸单酯富集, 进一步去除其中的水溶性杂质。检测方法是高效液相色谱法, 色谱柱为苯基柱, 替代了传统使用的C18柱, 能够更有效的分离邻苯二甲酸单酯, 为研究儿童的邻苯二甲酸酯暴露水平提供参考。 1 材料和方法 1.1 色谱-质谱条件 Waters2695。高效液相色谱, 2489紫外检测器, GP-Phenyl 120A型色谱 (4.6mm×250mm, 5μm, 美国赛分科技有限公司) , Waters OASIS HLB固相萃取柱 (3mL/60mg和6mL/200mg) , 12位负压固相萃取装置 (天津艾杰尔有限公司) , DC12型氮吹仪 (上海安谱科学仪器有限公司) 。 1.2 试剂 1.2.1 邻苯二甲酸酯/mehp的合成 邻苯二甲酸单丁酯 (MBP) 、邻苯二甲酸单苄基酯 (MBzP) 、邻苯二甲酸 (2-乙基己基) 单酯 (MEHP) (美国Accustandard公司) , 纯度均≥99%。 1.2.2 试剂:乙腈、高纯水、磷酸质酸钠、磷酸盐酸钠;乙酸乙酯、磷酸乙酯、磷酸乙酯、磷酸钠、磷酸乙酸钠、总酸钠;乙酸乙酯,总氨酸钠试剂,苯酸二氢钠样品2-表1 β-葡糖甘酸酶来自大肠杆菌 (125KU, 美国Sigma-Aldrich公司) , 乙腈、高纯水、冰醋酸 (色谱纯试剂) , 乙酸乙酯、醋酸铵、磷酸二氢钠、85%的磷酸, 30%的氨水溶液 (分析纯试剂, 国药集团化学试剂有限公司) 。 1.3 试剂的制备 1.3.1 标准溶液 称量MBP、MBzP、MEHP各0.1g, 分别用乙腈溶解并定容至50mL, 配制成2g/L的标准储备液, 置于4℃冰箱中储存备用。 1.3.2 -葡萄糖甘酸酶溶液 称取12mgβ-葡糖甘酸酶, 用高纯水溶解并定容至100mL, 得200U/mL的β-葡糖甘酸酶溶液, 储存于-20℃冰箱中。 1.3.3 碱性缓冲液 量取1mL 30%NH3·H2O于体积比为50∶50的乙腈∶水 (200 mL) 中, 常温保存,