复元胶囊对体外原代培养软骨细胞凋亡的影响及机制研究.docxVIP

复元胶囊对体外原代培养软骨细胞凋亡的影响及机制研究 骨关节炎（oa）是老年人最常见的慢性和刺激性关节疾病。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞,在软骨形成、代谢以及修复中起着极其重要的作用。研究发现在骨关节炎病变过程中有软骨细胞凋亡的特征性形态,如染色质凝聚、核碎片、细胞皱缩、凋亡小体等,软骨细胞凋亡已被认为是关节软骨退行性改变的病理因素之一。有学者报道,在NO供体硝普钠(SNP)诱导的软骨细胞凋亡信号转导过程中,细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase,包括ERK1和ERK2)信号通路能抑制凋亡信号的传导,抑制软骨细胞的过度凋亡,而用ERK1/2特异性抑制剂U0126阻断ERK1/2信号通路可促进软骨细胞的凋亡。复元胶囊是临床上长期用于治疗骨关节炎有效的经验方复元汤研制而成的中药实验制剂,但是其分子水平的作用机制尚不十分清楚。本实验通过建立软骨细胞体外培养体系,观察复元胶囊血清对SNP诱导的软骨细胞凋亡的影响,并从信号转导的角度,检测了参与软骨细胞凋亡信号转导的磷酸化ERK1/2及其下游靶基因p53蛋白质的表达和凋亡执行因子caspase-3的活性,并观察ERK1/2特异性抑制剂U0126阻断ERK1/2信号通路后上述指标的变化,旨在研究中药复元胶囊抑制软骨细胞凋亡的分子机制,探讨其治疗骨关节炎的作用机制。 1 材料和方法 1.1 大鼠、大鼠、大鼠 雄性3 w龄SD大鼠10只,体重40～60 g;雄性成年SD大鼠20只,体重200～250 g。均由重庆医科大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SYXK (渝)2002007。 1.2 胶囊的制作 复元胶囊,由人参、淫羊藿、鹿茸、黄芪、川芎、当归、枸杞子等组成,委托重庆希尔安药业有限责任公司制成胶囊,仅供实验使用。SNP为北京双鹤现代医药技术有限责任公司产品,批号:H111021635。 1.3 免疫药物的免疫药物研究 FD培养基(Hyclone公司)、优级胎牛血清(Hyclone公司)、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、总蛋白提取试剂盒(升博生物公司)、U0126(上海康成生物公司)、AnnexinⅤ-FITC试剂盒(晶美生物工程有限公司)、磷酸化抗体ERK1/2一抗(上海康成生物公司)、p53一抗和蛋白内参β-actin(Santa Cruz公司)、PBS缓冲液和辣根酶标记兔抗山羊IgG二抗(北京中山生物技术有限公司)、免疫印迹化学发光试剂(碧云天生物公司)、PVDF膜(Millipore公司)、caspase-3比色法检测试剂盒(Bio Vision公司)。 1.4 方法 1.4.1 胎牛血清fd活性的制备 参照文献,将3 w龄SD大鼠断颈处死后,无菌条件下分离股骨头,尽量剔除周围组织,浸入含青霉素和链霉素的双抗水中漂洗3次,FD培养基中漂洗3次,再次清除软骨周围附带组织;将软骨剪成1 mm3大小,移入0.25%胰蛋白酶中,37℃水浴箱中消化30 min;胎牛血清终止消化,PBS缓冲液清洗2遍;再加入0.2%Ⅱ型胶原酶,37℃水浴箱消化,每30 min轻轻摇荡一次,4 h后消化成絮状;1 000 r/min离心5 min,弃上清,PBS缓冲液清洗1遍;加入含15%胎牛血清FD培养基制成细胞悬液,用200目不锈钢筛网过滤后接种于培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱进行原代培养。倒置显微镜下观察细胞长满80%后传代培养,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色鉴定细胞。 1.4.2 灌胃水处理组u2005 200～250 g的雄性SD大鼠20只,随机分成2组,即复元胶囊组(10只)和空白对照组(10只)。复元胶囊组按Meeh-Rubner公式给予10倍等效剂量药物,充分溶于生理盐水后灌胃;空白组给予等体积的生理盐水灌胃,每日2次,连续3d。末次灌胃后2 h腹主动脉取血,4℃静置过夜,3 000 r/min离心20 min,取上清,经0.22μm抽滤除菌后,分装,-20℃保存备用。 1.4.3 培养基的制备 分为正常组(含15%胎牛血清的FD培养基正常培养)、模型组(2 mmol/L SNP+FD培养基)、空白血清组(2 mmol/L SNP+含10%空白血清的FD培养基)、中药组(2 mmol/L SNP+含10%复元胶囊血清的FD培养基)、抑制剂组(2 mmol/L SNP+50μmol/L U0126+无血清的FD培养基,预先用U0126孵育1 h,再加入SNP和培养基)、中药+抑制剂组(2 mmol/L SNP+50μmol/L U0126+含10%复元胶囊血清的FD培养基,预先用U0126孵育1 h,再加入SNP和培养基)。 1.4.5 细胞同步化培养 选用第2代软骨细胞,2×105个/ml密度种植