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液相色谱-串联质谱法的原理及应用 液体层析成像法（lc-ms）将广泛使用的分离方法与具有特异性的性质光谱方法相结合，提供相对分子量和结构信息。这是现代分离分析的重要方法。虽然与LC相连的单极质谱仪也能够提供相对分子质量的信息,但不足之处在于基质对待测组分的干扰难以排除及待测组分的结构信息不能充分利用。液相色谱与串联质谱联用可在一级质谱MS条件下获得很强的待测组分的准分子离子峰,几乎不产生碎片离子,并可对准分子离子进行多级裂解,进而获得丰富的化合物碎片信息,可用来推断化合物结构,确认目标化合物,辨认重叠色谱峰以及在高背景或干扰物存在的情况下对目标化合物定量,因而成为药物代谢过程和产物研究,复杂组分中某一组分的鉴定和定量测定,以及药用植物成分研究中更为强有力的工具。本文对液相色谱-串联质谱法(LC-MSn)的原理及其在药物代谢方面的应用作简要介绍。 1 串联质量分析msms的基本原则 1.1 耦合等离子体离子化 离子源的种类包括:电子轰击电离(EI)、化学电离(CI)、快原子轰击(FAB)、场电离(FI)和场解吸(FD)、大气压电离源(API)、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)和电感耦合等离子体离子化(ICP)等。现在主要采用大气压离子化技术(API),包括电喷雾离子化(ESI)、大气压化学离子化(APCI)和大气压光电离化(APPI)。API是软电离技术,通常只产生分子离子峰,因此可直接测定混合物。其中,ESI应用十分广泛,适用于极性、热不稳定、难气化的成分分离分析,小到无机离子,大到蛋白质、核酸。 ESI-MS中可以容易地控制碎片的裂解程度。用串联质谱可以选择特定的离子,通过碰撞诱导解离(CID)使其碎裂成碎片离子;另一种方法是通过改变锥孔(取样口)电压(源内CID)的方式,无选择地将源内所有的离子击碎。 1.2 质谱扫描特性 质量分析器是质谱计的核心,不同类型的质量计其功能、应用范围、原理和实验方法均有所不同。 磁质谱:分为单聚焦磁场分析器和双聚焦分析器。离子源中生成的离子通过扇形磁场和狭缝聚焦形成离子束。离子离开离子源后,进入垂直于其前进方向的磁场。不同质荷比的离子在磁场的作用下,前进方向产生不同的偏转,从而使离子束发散。由于不同质荷比的离子在扇形磁场中有其特有的运动曲率半径,通过改变磁场强度,检测依次通过狭缝出口的离子,从而实现离子的空间分离,形成质谱。高分辨的双聚焦质谱仪可以测定分子离子的精确质量数(误差在5 ppm以下),可以确定元素组成。 四极杆分析器(简写为Q):因其由四根平行的棒状电极组成而得名。离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦,一个直流固定电压(DC)和一个射频电压(RF)作用在棒状电极上,两对电极之间的电位相反。对于给定的直流和射频电压,特定质荷比的离子在轴向稳定运动,其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。将DC和RF以固定的斜率变化,可以实现质谱扫描功能。四极杆分析器对选择离子分析具有较高的灵敏度。 离子阱分析器(TRAP):由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地,环电极施加射频电压(RF),通过施加适当电压就可以形成一个势能阱(离子阱)。根据RF电压的大小,离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子,待离子累积到一定数量后,升高环电极上的RF电压,离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱,被电子倍增监测器检测。离子阱分析器现已可以分析质荷比高达数千的离子。离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度,而且单个离子阱通过时间序列的设定就可以实现多级质谱(MSn)的功能。 飞行时间分析器(TOF):具有相同动能,不同质量的离子,因其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离,则不同质量离子的飞行时间不同,质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。离子以离散包的形式引入质谱仪,这样可以统一飞行的起点,依次测量飞行时间。离子包通过一个脉冲或者一个栅系统连续产生,但只在某一特定的时间引入飞行管。TOF具有较大的质量分析范围和较高的质量分辨率,尤其适合蛋白等生物大分子分析,常用MALDI为离子源。其分辨率随着质荷比的增大而降低。 傅里叶变换-离子回旋共振分析器(FT-ICRMS):在一定强度磁场中,离子做圆周运动,离子运行轨道受共振变换电场限制。当变换电场频率和回旋频率相同时,离子稳定加速,运动轨道半径越来越大,动能也越来越大。当电场消失时,沿轨道飞行的离子在电极上产生交变电流。对信号频率进行分析可得出离子质量。将时间与相应的频率谱利用计算机经过傅里叶变换形成质谱。优点为分辨率很高,质荷比可以精确到千分之一道尔顿,但价格十分昂贵。 液相色谱与串联质谱联用的质量分析器中最常用的是四极杆分析器,其次是离子阱分析器和飞行时间分析器。 1.