实验三枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶课件.pptxVIP

生物技术综合实验 2010.3 实验三、枯草芽孢杆菌 碱性磷酸酶的提取和酶活测定 n 学习盐析法提取碱性磷酸酶； n 学习透析法脱盐； 实验目的 n 渗透压冲击法破裂细胞； n 分级盐析法提取碱性磷酸酶； n 透析法脱盐； n 酶活测定的原理。 实验原理 n 原理： 碱性磷酸酶前体一般存在于外周胞质中，在跨膜分泌的过程中 加工为成熟的碱性磷酸酶，故成熟的碱性磷酸酶为存在于质膜上的一种 膜结合蛋白。 因此本实验采用渗透压冲击法抽提碱性磷酸酶， 在高渗的环境中(一定 浓度的 Mg2＋溶液) 使目的物慢慢分泌出来。 n 碱性磷酸酶的性质： 1. 碱性磷酸酶是二聚体，单体分子量约为47KDa； 2. 在偏酸性环境中易失活，较耐热， Mg2＋ 可增加其热稳定性； 3. 因Zn2＋ 是保持酶活的重要离子，故提取过程中要防止金属螯合剂； 注： 1、在Tris培养基中(缺磷营养胁迫下)，枯草芽孢杆菌的 碱性磷酸酶合成量增加，其活性也会有所增强。 2、枯草芽孢杆菌发酵生产碱性磷酸酶的最佳条件是pH7.4， 40度培养10h 。 渗透压冲击法破壁 n 原理： 高浓度的中性盐溶液中存在大量的盐离子，它们能够中和蛋白质表面的电 荷，使其赖以稳定的双电层受