动物细胞培养制药工艺课件.pptxVIP

动物细胞培养制药工艺 *4.1 制药动物细胞 *一 动物细胞的结构与功能动物细胞的结构与功能细胞膜细胞质细胞核没有细胞壁亚细胞器 *动物细胞培养的代谢特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代谢的前体。葡萄糖限制葡萄糖限制：通过增加谷氨酰氨消耗得以补偿，反之通过增加谷氨酰氨消耗得以补偿，反之亦然。葡萄糖代谢：糖酵解为主，，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。另一条途径为TCA循环，彻底氧化产生CO2和水。一小部分为戊糖磷酸途径，生成生成4、5、7碳糖和NADPH。中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞有毒性。 *Gln代谢：脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。Gln氮源，Gln受限，增加其他氨基酸消耗以补偿。 离体动物细胞系，转氨作用是主要代谢途径。谷氨酰胺在脱氨酶的催化下，脱氨产生氨，对细胞有毒性。谷氨酰氨与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入培养液并积累。Gln能量：Glu转化为α-酮戊二酸，进入TCA循环。流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物的积累。 *蛋白质糖基化与分泌表达 蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体 糖基化场所：内质网合成各种糖类，粗糙内质 网腔内和高尔基体，加工修饰。 不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞 系。 对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放 到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。 *二 制药动物细胞的种类目前用于制药的动物细胞有4类：原代细胞系二倍体细胞系异倍体细胞系融合的或重组的工程细胞系 *细胞系分类来源：原代细胞，传代细胞。寿命：有限细胞系，无限细胞系。染色体数目：二倍体细胞系，异倍体细胞系。获得方式：工程细胞系，癌变细胞系。生长特性：贴壁依赖型，非贴壁依赖型细胞系。 *4.2 动物细胞的生产特征 *一 对培养条件要求严格动物细胞对周围环境十分敏感无细胞壁保护，细胞膜直接接触外界。物理化学因素：渗透压、pH、离子浓度、剪切力等耐受力很弱，容易受伤害。与细菌和植物细胞相比，动物细胞培养条件要求严格地多。 *1 温度哺乳动物细胞最佳培养温度为 37℃鸡细胞为 39℃ ～ 40℃；昆虫类细胞为 25℃ ～28℃。耐受温度范围较窄，35℃～37℃细胞受伤：39℃～40℃ 1小时，但能恢复。受伤严重：41℃～42℃，部分可恢复。 死亡：43℃以上。 *2氧气动物细胞生长必须有氧气，缺氧时不能生存。离体培养的气体：含有 5％CO2和95％空气，其中氧浓度为 中氧浓度为21％。高氧环境：O2浓度 60%以上，对细胞毒性较大，抑制生长和增殖，出现染色体异常等现象。 有时充以 有时充以N2气稀释O2浓度。 *3 pH值低于6.8或超过 7.6会对细胞产生严重影响甚 至使细胞死亡。 机体细胞的pH 范围为6～8，而且在血液和体 液中，变化范围很小。 人体 ：血液pH比较恒定，7.36～7.44。 低于7.05 发生酸中毒，高于 7.45发生碱中毒。 *4 渗透压正常血浆渗透压为280～310 mOsm/kg高渗溶液：高于310 mOsm/kg低渗透压溶液：低于280mOsm/kg。动物细胞对渗透压有较强的耐受性离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液。 增减 NaCl 的浓度调整渗透压，每增加 1mg/ml NaCl，渗透压增加32 mOsm/kg。 *二 对培养基组成要求高动物细胞对培养基的要求高完全异养，容易利用、相对低分子量的营养物12中必需氨基酸8种以上维生素多种无机盐和微量元素多种附加成分：生长类、细胞因子和贴壁因子因子及激素、结合蛋白质能源：单糖，葡萄糖，谷氨酰氨氮源：氨基酸单体化合物 *三 天然结构与活性的药物完善的翻译后蛋白质修饰功能游离核糖体：合成细胞质基质内的蛋白质。与膜结合的核糖体：合成分泌性和膜整合蛋白，多数为糖蛋白。修饰：内质网加工，高尔基体加工、转运、分泌，糖链。糖基化、磷酸化、酰胺化等。活性分子：装配折叠形成精确的三维结构。 *四 生产工艺特征产品与天然的产物一致：适于临床使用动物细胞生产：70％蛋白质药物。培养工艺：难度大，产量低，成本高。胞外分泌产物：分离纯化简单。有潜在的血源性污染危险。 *4.3 动物细胞培养技术 *一 细胞生长和基质依赖性生长基质接触抑制贴壁依赖性细胞非贴壁依赖性细胞兼性贴壁细胞 *1 生长基质概念：growth substratum把改变生长表面特性，促进细胞贴附的物质。胞外基质成分：多聚赖氨酸胶原 *2 接触抑制概念：contact inhibition细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。特点：保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加。有：大多数细胞无：少数悬浮培养细胞（癌细胞） *3 贴壁依赖性细胞概