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菌种传代与保藏作业指导书 菌种传代与保藏作业指导书 标准菌的来源 标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（ 0 代）（提供菌种证书）。 标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的 0 代原始菌种储存于－20℃， 有效期为三年。购买的已接种好的菌种斜面（3 代）应检查菌种管是否完好。储存于 2～ 8 ℃，有效期为 3 个月。 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及 75%酒精棉球 培养基 改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、 乙型副伤寒沙门菌、短小芽袍杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 3. 3 操作步骤： a ．打开洁净工作台。 在安额的外表面用75％的酒精擦拭并让其自然风干。 用一小砂轮在安瓶的上部划一条，用线手轻轻将安瓶帣开（开启安 瓬时必须小心，因为安瓬遇热时可能会破裂）。 以无菌方法用一无菌 吸管从巳准备好的上述 液体培养基 中移取 0. 5~ 0. 8m 1 到 安 瓶 中 。e．轻轻地旋转安瓶以使冻千菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f ．用无菌吸管将安瓶内菌液全部转接到相应的液体培养基。 根据安瓶上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30,...._,35 °C , 培养18 ~ 24 小时； 真菌培养温度23~ 28°C， 培 养 3~ 5 天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长； 若不浑浊， 细菌应延长培养时间至7 天， 真菌应延长培养时间至14 天， 若仍未浑浊，灭菌处理。 取经复苏后的上述细菌菌8液- l Oml 至液体培养基中按 g 项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml 20％的无菌甘油混匀， 1- 2ml／ 管分装于冻存管。每个菌种制备 10 支， 按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其 余作为储备管。黑曲霉的 h 项下洗脱液按 h 项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液 20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入 20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备 10 支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。 储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。 菌种确认 用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板 上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在 30～35℃下培养 2～3 天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在 23～28℃下培养 7 天；培养后，观察其菌落形态， 应符合该菌种形态特征。 污染处理 假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管 菌种的传代与保藏 将菌种接种至一新鲜培养基上，每萌发一次即称为一代，因此， 当原始菌种复溶并转至新培养基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第 0 代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第 1 代，直到第 3 代为工作菌种。菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过 5 代。 菌种的传代保藏过程 3.3 项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为第二代。 传第三代时取 1 支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第3 代。工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于实验用（S3）。 定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）： 从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约 30 分钟。 将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日 期，和传代菌种一并移入洁净工作台，打开紫外灯照射一小时。 关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约 30 秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。 右手用无名指、小指及掌部