Sanger测序流程分析和总结.docxVIP

Sanger 测序 一、原理 Sanger 法测序是利用一种 DNA 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)， 并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP 缺乏延伸所需要的 3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在 G、A、T 或 C 处终止并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G 结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的 PAGE 胶上电泳进行检测，从而获得可见的 DNA 碱基序列。 ABI 3730XL 测序仪是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛，可同时分析 96 个样品。该仪器采用 4 色荧光同时检测，可不间断 24 小时运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。 二、技术路线 三、操作流程 1、DNA 的提取 一般采用试剂盒提取（参考试剂盒提供的 protocol）。 2、PCR 扩增与电泳 ① 配置 PCR 体系（25ul 体系） DNA 浓度大于 30ng/ul（DNA 浓度需要测定）: 试剂名称 H2O 10*PCR buffer 2.5Mm dNTPs primer（前后引物各 1ul） LA Taq 酶 DNA 模板  用量 15.2μl 2.5μl 3μl 2μl 0.3μl 2μl 注意: 对于 CEBPA 和 NOTCH1 此类 GC 含量高的将 10*PCR buffer 2.5ul 换为 2*GC buffer 12.5ul, H2O 为 5.2ul。 每次 96 孔板加样后都必须贴封口膜，离心混匀（2000g 1min）, 防止挂壁。EP 管与 96 孔板等都为商品型一次性产品, 注意标记板号, 样本号和引物号。 ② 设置 PCR 反应程序 一般程序：96℃预变性 2min, 96℃ 30s, 57℃ 30s, 72℃ 2min, 35cycles; 72℃延伸 5min; 4℃/15℃∞。CEBPA 和 NOTCH1 程序：96℃预变性 5min, 95℃ 40s, 64℃/66℃ 40s, 72℃ 1min, 35cycles; 72℃延伸 5min; 4℃/15℃∞。 ③ 琼脂糖凝胶电泳 配置 1.5%（60ml 0.9g, 大胶板 150ml 2.25g）的琼脂糖凝胶, 再分别取 2ul loading buffer 与 4ul DNA 扩增产物混合后进行电泳, 160V 35min。 3、PCR 产物纯化 ① 配制消化液 TaKaRa Alkaline Phosphatase 虾碱酶TaKaRa Exonuclease I 外切酶 0.5μl 0.5μl 配置消化液, 分别取虾碱酶与外切酶 1:1 混合。PCR 产物离心后，每个孔中加入 1μl 以上消化液到 PCR 反应液中。 ② 纯化反应：上 PCR 仪进行程序反应。 程序为 SAP: 37℃ 60min, 80℃ 15min, 4℃/15℃∞。 4、测序反应 ① SEQ MIX 配 置 试剂：ABI PRISM? BigDye? Terminator v3.1 cycle Sequencing Kit 根据 PCR 反应的数量按照下表配制 MIX： 试剂名称BigDye Sequencing Buffer H2O Primer（3.2pmol/μl）（引物可单加） 模板（即 3-②中的产物） 用量0.4μl 0.8μl 1.8μl 1μl 1ul 按照测序反应表在 96 孔板中加入 3μl 以上 MIX，1μl 对应引物，1μl 对应 PCR 产物（注意封膜后要求压膜）,离心。（测序反应只有一个引物，为避免加样过程中的液体消耗，体系需要超量配置）。 ② SEQ 程序: 96℃预变性 2min, 96℃ 10s, 55℃ 5s, 60℃ 90s, 25cycles; 4℃/15℃∞。 5、纯化 此步骤是将测序反应体系中除目标单链核酸片段之外的杂质尽可能去除, 以减少 ABI 3730 毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。 ① 试剂准备： 0.125 mol/L EDTA-Na2 0.125 mol/L EDTA-Na2 溶液：称取 2.325g EDTA-Na2·2H2O 于 50ml 离心管中，加入40ml 去离子水， 65℃水浴加热，间歇振荡几次至完全溶解，用去离子水定容至 50ml ，振荡 10 秒混匀。 无水乙醇（优级纯） 去离子甲酰胺 HIDI ② 将无水乙醇与蒸馏水混合配制成 85%乙醇，70%乙醇，当天使用。 ③ 测序反应板离心后，每个反应孔加入 EDTA-Na2 溶液 2.5μl，85%乙醇 40μl，充分震荡 3mi