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大肠杆菌生长曲线测定 实训目的 1 ．了解光电比浊计数法的原理。 2 ．了解细菌生长曲线的特点，绘制生长曲线。 3. 掌握光电比浊计数法测定大肠杆菌生长曲 线的方法。 752型分光光度计构造原理 • 752型分光光度计在构造原理上是由光源室、单色 器、试样室、光电管暗盒、电子系统及数字显示 器等部件组成。光源除了钨卤素灯外，还有氢弧 灯(或氘灯)。波长范围为200nm~850nm。 • 752型分光光度计能在紫外和可见光谱区域内对样 品物质作定性和定量分析 . 使用方法 (1)预热仪器 将选择开关置于“T”，按下“电源”开关。 (2)选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的 单色波长。 (3)固定灵敏度挡 (4)调节T=0% 轻轻旋动零旋钮，使数字显示为“00.0”，(此 时试样室是打开的)。 (5)调节T=100% 将盛蒸馏水(或空白溶液，或纯溶剂)的 比色皿放入比色皿座架中的第一格内 (6)吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上试样 室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋 钮，使数字显示为“ .000”。将盛有待测溶液的比色 皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖， 轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时 数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后， 打开试样室盖，切断光路。 • (7)关机 实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗 净，并将比色皿座架用软纸擦净。 注重事项 (1)为了防止光电管疲惫，不测定时必须将试样室 盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。 (2)取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃 面，而不能碰比色皿的光学表面。 (3)比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤， 也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶液 应用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭， 以免损伤它的光学表面。 • 细菌培养物在生长过程中，由于原生质含 量的增加，会引起培养物混浊度的增高。 细菌悬液的混浊度和透光度成反比、与光 密度成正比，透光度或光密度可借助光电 比浊计精确测出，因此可用光电比浊计测 定细胞悬液的光密度(OD值)，表示该 菌在特定实验条件下的细菌相对数目，进 而反映出其相对生长量。 方法和步骤 1．接种、培养 • 采用无菌操作技术用移液管向每个100ml营养肉汤 培养基的三角瓶中试管准确加入大肠埃希菌悬液 3ml，轻轻振荡混匀，另设一空白对照组(不加大 肠埃希菌悬液)。 将接种后的9组三角瓶置于摇床上， 37℃,220r/min ， 振荡培养。间隔一定时间，即0、1、2、3、4、5、 6、7、8、9~18小时后，从摇床上将取下其中一瓶 三角瓶培养物(标记时间)，置4℃冰箱保存。 • 2．比浊测定 • 每组取9支干净小试管，从不同时间培养菌液中摇 匀各取3ml，将大肠埃希菌培养液进行适当稀释， 使光密度在0.1~0.65之间，以没有接种的空白对 照组液体培养基调零点，在600nm波长， 1cm比 色杯中依次进行测定OD值。测定从最稀浓度的菌 悬液开始，依次测定。 • 经稀释后测定的OD值要乘以稀释倍数，才是培养 液的实际OD值。 3．绘制生长曲线 . 以光密度(OD值)为纵坐标，培养时间为横 坐标，绘制大肠埃希菌的生长曲线。 . 注意事项：测定OD值前，将待测的培养液 振荡，使细胞均匀分布。测定OD值后，将 比色杯的菌液倾入容器中，用水冲洗比色 杯，冲洗水也收集于容器中进行灭菌，最 后用75%酒精冲洗比色杯。 . 思考题：分析你所绘制大肠杆菌生长曲线 的特点？为什么？ 水中细菌总数的检测 • 2人/组 准备 • 营养琼脂120ml，生理盐水 100ml(0.9gNaCl) • 平皿7套，试管2支， 1ml移液管4支， 10ml 移液管2支 • 预习课本260页