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流式细胞仪上机操作培训手册 一、样本处理 以PBMC外表抗原的流式检测步骤为例 1） 取样。取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC； 2） 编号。根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管： a） 1号管：相应同型对照； b） 2 号管：CD3,CD4,CD8,CD56 四标管； 3） 加样。用移液器取100ul细胞/管〔约1x106个细胞/管〕，分别加到已经标记 好的流式管底部； 4） 洗涤。参加 1ml PBS/管，涡旋 1600rpm/min，离心 6min； 5） 染色。弃上清，参加100心PB管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流 式管中参加相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min〔操作尽量 保持在避光条件下进展。〕 6） 洗涤。参加 1ml PBS/管，涡旋 1600rpm/min，离心 6min； 7） 重悬。弃上清，参加0.5ml PBS/管，混匀，上机检测（可选择BD FACSCanto II 或 BD Accuri C6）。 〔注：假设不能及时上机，应参加4%多聚甲醛固定，并于4°C避光保存。〕 8〕试验结果分析。〔注：实验过程中如果进展多色标记，需要调节荧光补偿〕。 参考值： CD3+ 60.8-75.4% CD4+ 29.4-45.8% CD8+ 18.2-32.8% NK 〔CD3-CD56+〕 9.5-23.5% 二、上机检测 BD FACSCanto II简要操作流程 启动流式细胞仪 1翻开流式细胞仪电源 2启动计算机，翻开软件登录 3确保软件连接到流式细胞仪 必要时，点击 Cytometer connectBD FACSDiva检查液体水平 必要时，点击 Cytometer connect BD FACSDiva 检查液体水平 1启动流式细胞仪后，检查液体水平 低液面水平或者废液桶满都用红色指示。 1Th e t/Ttem i;n?nt)/d \FACS Flew 1 Th e t/Ttem i; n?nt) /d \ FACS Flew I 关机滔液 BD FACSDiva BD FACS Canto 2如果液流车未自动开启，选择Cytometer Fluidics Startup。 3当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。 检查气泡 1在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。 4-2流动室 在此处检查是否有气泡 在此处检查是否有气泡 2如果没有看到气泡，进展第5步。如果看到气泡，点击Cytometer Cleaning Modes De-gas Flow Cell. 3当完成信息出现后，点击OK。 4如果还可以看到气泡，重复上述操作。 注意：如果翻开流动室细胞进口门时出现错误信息，通过关闭进口门，并等待30秒关 闭该信息。 5当您完成上述操作后，在往下进展之前请先检查激光预热是否已经完成。 IL ICtrir IL I Ctrir BD FACSCanto 己仙「i ；? 己仙「i ；?m J BD FACS Diva 创立实验 1按照需要，在工作区工具栏中点击相应的按钮来显示浏览器、细胞仪、检测器、工作表、 获取控制板和双指数编辑器窗口。 2创立文件夹： A在浏览器中选择数据库图标，并点击浏览器工具栏上的New Folder。 B对该文件夹命名。 数据库图标 数据库图标 3选择该文件夹，点击New Experriment来创立一个新实验。 4对该实验进展重命名。 5选择实验级别的细胞仪设置，然后点击Inspector（检测器）中的Parameters（参数）选项卡。 E3 Inspeclar -匚yhmi中争 htlin# X , jt-rr- rn- ■，什□芸 Pzl zll tit5 Tht^eshald Hatu Camp e-rmticn 6按照需要变更，添加或者删除参数。 运仃样本并记录数据 1将样品管安装到流式细胞仪中并点击Aquire Data （获取数据）。 A把抽吸臂向左侧推。 B把流式管放置到SIT上，确保试管竖直，并用力向上推试管直到试管完个停顿并完个 就位。 C把抽吸臂放置到试管下的中心位置。抽吸臂上有3个传感器引脚。试管底部应定位在 这些引脚的中心位置内。 2调节FSC和SSC电压以正确显示细胞的散射光特征。 3必要时，点击阈值图标并对FSC阈值进展调节。 4调节P1门仅围绕目的细胞群体。 5调节好后，点击Record Data（记录数据）以记录数据。 6获取停顿，取出试管。 建立全局工作表 1如果用户参数中启用了 Default global worksheet（默认个局工作表）（默认选项），那么全局工 作表已经存在。展开全局工作表文件夹来定位和重命名工作表。〔注：如果Default global worksheet被禁