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一种海洋微藻中多不饱和脂肪酸的富集 海洋微藻中pufas的提取 结果表明，puf（牛仔布斯特）是人类和动物生长发育所必需的脂肪酸。PUFAs目前主要从鱼油中提取,但其加工处理复杂污染严重。海藻作为PUFAs的又一主要来源具有很大的潜力,天然海藻资源丰富,而海洋微藻约占海洋生物物种的40.86%,微藻还可以通过简单的营养素的培养,有生长周期短、收获快等优点,而且可以通过生物工程方法和培养条件的控制来提高其PUFAs的含量。PUFAs的提取主要有低温冷冻结晶法、尿素包合法、吸附分离法、分子蒸馏法、脂肪酶提取法、膜分离法以及二氧化碳超临界萃取法等。目前报道的从海藻中提取PUFAs主要是利用二氧化碳超临界萃取。这一方法设备昂贵、操作条件要求高、工业化困难。尿素包合法利用尿素分子和一些直链分子(如直链饱和脂肪酸及其酯类)同时存在时,会形成内含直链分子的六方柱包合物结构而结晶析出,当脂肪酸链中含有双键较多时,使分子形状弯曲,造成体积很大而不易与尿素形成此类包合物。本实验在已有多不饱和脂肪酸提纯的基础上初步研究了采取尿素包合法利用海藻提取多不饱和脂肪酸的工艺。 1 材料和方法 1.1 藻粉系的培养 微藻藻粉 藻种Nannochloropsis sp获自中科院水生生物所(武汉),实验所用藻粉系由本实验室自行培养。 培养条件 用f/2培养基在2.5 L气升式光反应器内培养,光培养条件为光照度60 (m-2s-1),培养温度23 ℃,循环冷凝维持恒温培养6 d,收获藻细胞离心(3 000 r/min,30 min)后冻干,然后在60 ℃烘干至恒质量得干藻粉。 1.2 瓦里安仪器公司 Varian CP-3800气相色谱仪, 瓦里安仪器公司;AB104-N电子天平, 上海METTLER TOLEDO有限公司;十七碳酸甲酯标准品, SIGMA公司。 1.3 实验方法 1.3.1 藻细胞的研磨破碎 由于微藻细胞和其他植物细胞一样具有较厚的细胞壁,比较难破碎,酶溶或超声波破碎的方法结果均不好,本实验采取研磨的方法破碎,可以加入钢砂加强研磨的效果,在显微镜下观察,大部分细胞被破碎。 藻粉经充分研磨后,加入无水乙醚和石油醚的混合溶剂(不同体积配比)粗提取粗脂,适当振荡混匀。并且加入质量分数10%的KOH沉淀藻细胞,然后在4 000 r/min条件下离心15 min取上层清液。在60 ℃水浴迅速蒸去多余的溶剂至溶液恒重。 1.3.2 koh皂化皂化 在蒸去多余溶剂后的溶液中加入等体积饱和KOH-甲醇溶液(0.4 mol/L,加热使KOH完全溶解)皂化6 h或过夜,为避免高温氧化,置于冷藏室进行。然后用HCl稀溶液(商品浓盐酸与去离子水以体积比9∶1稀释)调节pH值至1～2,再加入少量H2O使溶液分层,离心分离取上层油层。 1.3.3 冷冻层法制备混合脂肪酸 配制不同质量浓度的尿素-甲醇溶液,加入到混合脂肪酸中,置冰箱冷冻层(-20 ℃)形成包合物至不再有结晶物析出(2 h)。水洗后离心得多不饱和脂肪酸粗品。 1.3.4 gc/ms检测条件 参照Carreau等()的方法,以脂肪酸甲酯的正己烷浓缩溶液上气相色谱测定。 气相色谱样品处理。取上述多不饱和脂肪酸粗品0.2 mL加入0.1 mL 17∶0(表示十七碳0个双键)脂肪酸甲酯标准样品,上柱测定。 气相色谱条件。色谱柱为瓦里安CP-sil 5 CB毛细管柱,规格为30 m×0.25 mm×0.25 μm;柱压为110 kPa);分流进样,分流进样体积比30∶1,进样量0.000 2 mL;进样口温度250 ℃;程序升温条件:初始温度150 ℃,保留1 min(升温速率5 ℃/min)至220 ℃,再升温至280 ℃(升温速率20 ℃/min),保留15 min;检测器采取FID(氢火焰)检测器,检测温度280 ℃。各气流速:载气N2为2 mL/min,H2为30 mL/min,空气为300 mL/min。 2 结果与讨论 2.1 粗油提取最佳工艺条件的确定 因E.G.Bligh和W.J.Dyer的氯仿-甲醇提取油脂的方法的剧毒性和难回收,实验采取乙醚和石油醚混合溶剂提取粗脂。经实验发现脂肪的提取主要受溶剂配比、温度、提取时间四个因子的影响,以乙醚体积用量、石油醚体积用量、提取温度、提取时间四因素三水平进行正交实验,确定实验最佳提取工艺条件。实验安排如表1所示。 从藻粉中提取出的粗脂越多,得到的蒸去多余溶剂的溶液质量也越大,实验得正交表如表2所示。 由正交实验结果(见表2)可见对提取影响最大的为加入石油醚的体积,其次分别为加入乙醚的体积、提取的温度、提取的时间。从实验结果可知当乙 醚和石油醚的体积比为1∶2、提取温度20 ℃、提取时间5 h时为实验室粗油提取的最佳工艺条件。在此条件下,仍取0.1 g同批藻粉做重