、蛋白质的显色反应.docxVIP

实验二 蛋白质的显色反应 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接形式。 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 二、呈色反应 1、双缩脲反应 原理： 尿素加热至 180oC 左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相 似，也能发生此反应（ 二肽和氨基酸都不能发生双缩脲反应 ）。可用于蛋白质的定性或定量测定。 反应式如下： 双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有，含有一个肽键和一个-CS-NH , 2 -CH -NH , -CHR-NH , -CH -NH -CH-NH -CH -OH 或-CHOHCH NH 2 2 2 2 2 2 2 2 2 等基团的物质以及乙二酰二胺 等物质也有此反应。NH 也干扰此反应，因为 NH 与 Cu2+可生成暗蓝色的络离子 Cu（NH ） 2+。 3 3 3 4 因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是 蛋白质或多肽。 试剂 ①尿素，②10%氢氧化钠溶液，③1%硫酸铜溶液，④2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液： 水= 1：9） 操作 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时， 停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约 1mL，振荡混匀，再加 1%硫酸铜溶液 1 滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。（由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红色） 向另一试管加 2%卵清蛋白溶液（改为蛋清溶液：水= 1：9）约 1mL 和 10%氢氧化钠溶液约 2mL，摇匀，再加 1%硫酸铜溶液 2 滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。 2、茚三酮反应 (1) 原理 蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有 -氨基酸均能发生该反应 ，除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色反应 外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生成蓝色化合物。氨、 β- 丙氨酸和许多一级氨化合物都有此反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈 现此反应。因此，虽然蛋白质或氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮反应呈阳性反应的 不一定都是蛋白质或氨基酸。该反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化脱氨形成酮酸，酮 酸脱羧成醛，放出 CO 2 、NH ，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原 3 型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有蓝色 物质。反应机理如下： 蓝紫色 该反应非常灵敏，1：150 万浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。但在定性、定量测定中，一方面要严防干扰物存在，另一方面要在适宜的 PH 条件下进行测定。该反应的适宜的 PH 为 5～7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同 pH 条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 （2）试剂 ①蛋白质溶液： 2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1：9），②0.5%甘氨酸，③ 0.1%茚三酮水溶液，④0.1%茚三酮-乙醇溶液。 （3）操作 ①沸水浴中加热 1～2 分钟，观察颜色由粉色变紫色再变蓝色（pH 不同颜色深浅不同）。 ②在一小块滤纸上滴一滴 0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴 0.1%茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 3、黄色反应 原理 含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物 在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以呈黄色反应， 苯丙氨酸不易硝化，须加入少量浓硫酸才有黄色反应。 试剂 ①鸡蛋清溶液（将新鲜鸡蛋清用 6 层纱布过滤，然后按鸡蛋清：水=1：20 配制而成。 ②大豆提取液：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。 ③头发。④指甲。 ⑤0.5%苯酚溶液。⑥浓硝酸。⑦0.3%色氨酸溶液。⑧0.3%酪氨酸溶液。⑨10%氢氧化钠溶液。 操作 管号1234567材料鸡蛋清溶液 大豆提取液 指甲 头发 0.5%苯酚 0.3%色氨酸 0.3%酪氨酸浓硝酸 管号 1 2 3 4 5 6 7 材料 鸡蛋清溶液 大豆提取液 指甲 头发 0.5%苯酚 0.3%色氨酸 0.3%酪氨酸 浓硝酸 4 滴 4 滴 少许 少许 4 滴 4 滴 4 滴 现象 1 现象 2 4、考马斯亮蓝反应 （1）原理 考马斯亮蓝 G250（R250）具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在 呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。 它染色灵敏度高，比氨基黑高 3 倍。反应速度快，约在 2 分钟左右时间达到平衡