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乳腺癌her-2neu免疫组化检测方法的改进 在乳腺癌的组织病理学检查中，检测到h-2和neu（c-erb-2）的发现状态以及是否使用h-x。评价Her-2/neu状态的最客观方法是直接检测基因扩增, 但原位杂交目前难以普及, 国内、外大多数实验室还是使用免疫组化方法检测蛋白的表达。影响免疫组化染色的主、客观因素很多, 必须标准化其程序才能达到检测的目的。Dako公司Hercept Test虽然是美国食品和药物管理局推荐的Her-2/neu免疫组化标准试剂盒, 但其价格较贵, 真正在临床病理诊断中应用的也不多。因此, 大多数医院使用c-erbB-2来检测其表达状况, 同时采用Hercept Test评分标准来判定阳性强度。但是, 在c-erbB-2染色结果的判读中也存在主观上的不稳定性, 尤其是 (++) 的判读可重复性不高。因此, 我们设计了一个包含阴性和不同阳性程度的乳腺癌组织芯片, 作为常规乳腺癌c-erbB-2染色的对照。阅片者不仅可以根据对照片内的组织染色状况判定受测组织是否进行了正确的染色过程, 并且可以参照已知的阳性片染色得分给予受测组织最客观的得分。 1 材料和方法 1.1 乳腺癌组织诊断 收集北京友谊医院病理科2003-10—2004-06年间诊断为乳腺癌的病例79例, 均为4%中性甲醛固定、石蜡包埋的组织。然后, 制作组织芯片, 组织芯直径为2 mm。 1.2 型c-erbc-2 免疫组化染色采用EliVision二步法, DAB显色。浓缩型c-erbB-2为Dako公司兔多克隆抗体 (A 0485, 1∶300稀释) , 即用型第二代免疫组化EliVisionTMPlus广谱试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。 1.3 肿瘤组织非特异染色 评分参考FDA认证的Hercept Test标准及欧美临床实验室标准。阳性结果位于肿瘤细胞的胞膜, 正常乳腺胞质着色或肿瘤组织仅胞质着色均为非特异着色。评分标准:未见着色或10%的肿瘤细胞膜着色, 或仅有胞质非特异着色 (图1) 为 (-) ;10%的肿瘤细胞膜阳性表达, 显色弱且不连续 (图2) 为 (+) ;10%的肿瘤细胞膜阳性表达, 连续胞膜显色, 强度中等 (图3) 为 (++) ;10%的肿瘤细胞膜呈连续的强阳性表达为 (+++) (图4) 。 1.4 阳性对照芯片的设计 根据上述的评分标准, 79例中有33例 (-) , 19例 (+) , 10例 (++) , 14例 (+++) , 3例为癌周组织。从中再次筛选出11例用于制作阳性对照片的组织材料。阳性对照芯片具体设计见表1。然后, 制作组织芯片, 组织芯的直径为1 mm, 总面积大小为5 mm×4 mm。将组织芯片蜡块进行连续切片, 厚度为4 μm, 裱贴于经2%APES丙酮液处理过的载玻片远离标签的一端, 37℃烤箱内干燥后取出, 之后, 储藏于干燥的切片盒内以备使用。当需要做免疫组化染色时, 就将测试组织裱在组织芯片的旁边, 然后同时进行烤片、脱蜡以及免疫组化染色。 2 结果 2.1 染色组织的检测 阳性对照与被测组织相邻, 界限清楚, 易于阅片, 并且不影响被测组织的染色。经免疫组化染色后, 载玻片上的组织芯排列整齐, 无移位、脱失现象。 2.2 免疫组化染色 镜下观察, 阳性信号清楚, 位于细胞膜。阳性对照片内各组织点的免疫组化染色强度与初筛时相同, 可代表原组织。阅片者参照阳性对照中的各芯片点阳性等级判定其旁受测组织的染色得分。 2.3 第一次结果:多次阅片后,各受测组织对比 在多头显微镜下, 由2位高年资病理医师在熟悉评分标准的基础上同时对35张c-erbB-2染色片进行两次阅片, 分别打分。第一次只观察受测组织的染色状况, 然后直接打分, 结果如表2。第二次阅片时, 先参照每例受测组织旁边的阳性对照芯片的染色强度, 然后再给受测组织打分, 结果如表3。第一次结果判读的总一致率是85.7% (30/35) , 差异主要存在于 (+) 和 (++) 的判读上。第二次的一致率是97.1% (34/35) , 与第一次相比, 阅片者之间的可重复性提高。第一次判读不同的5例, 经过观察阳性对照芯片的染色情况后, 有3例判为 (++) , 1例为 (+) , 只有1例判读不同。 3 阳性对照的应用 由于Her-2/neu的过度表达是确定使用Herceptin治疗的指标, 因而其测试结果的可靠性和稳定性备受关注。在同一实验室内, 标本固定剂的类型和固定时间以及抗原修复的时间一般是统一的, 即已达到内部标准化, 因而可能影响c-erbB-2染色结果的主要因素是一抗的种类、浓度和孵育时间, 以及染色结果的分析等。为了确保染色片的质量和判读结果的准确性, 阳性对照不可缺少。传统上一般使用一张阳性片作为