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从水母中分离出的绿色荧光蛋白 2008年10月8日，瑞典皇家科学院荣誉委员会授予日本后裔诺贝尔化学奖，并授予美国科学家夏村秀、美国科学家马丁查尔飞和美国中国科学家钱永健。他们三人在发现绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)方面作出突出成就。 GFP大家都不陌生,细胞中散发着点点绿光,煞是好看。1962年被发现,1992年被克隆,中间隔了30年。而它在生物界中被广泛应用,也就是这十几年的事。GFP的具体研究历程到底是怎样的? 1 gfp的荧光指示剂—GFP研究的三个里程碑 1962年,下村修和约翰森从维多利亚多管水母(Aequorea victoria)中分离生物发光蛋白——水母素(aequorin)时,意外地得到了一个副产物。它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。来源于水母的野生型GFP在395 nm和475 nm分别有主要和次要的激发峰,它的发射峰在509 nm,处于可见光谱的绿色区域。1974年,他们得到了这个蛋白,当时称为绿色蛋白,之后改称绿色荧光蛋白(GFP)。GFP在水母中之所以能发光,是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP,刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。 当时的研究者们并没有意识到GFP的应用前景,慢慢就将其遗忘了。这一晃就是20年。直到1992年,道格拉斯·普瑞舍克隆并测序了野生型的GFP,文章发表在Gene杂志上。但具有讽刺意味的是,基金评审委员会认为普瑞舍的工作没有意义,不愿提供经费。普瑞舍一气之下,离开了科学界,将GFP的cDNA送给了几个实验室。很多人尝试用GFP的基因来表达蛋白,但都失败了。哥伦比亚大学的马丁·查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。他用PCR的方法扩增了GFP的编码区,将它克隆到表达载体中,通过UV或蓝光激发,在大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。这才是GFP作为荧光指示剂的真正突破,文章发表在Science杂志上。这个实验的重要意义是证明了从水母上分离出来的GFP基因可以在其他物种上表达,正确地折叠,发出荧光。这些研究成果为GFP在生物学研究上的使用,奠定了基础。 当时如果要研究活体生物中的生命活动,可以采用往细胞体内注射荧光化合物,或者是事先把荧光化合物结合到蛋白上,然后注射到细胞内的方式。钱永健此时已经是这个领域的专家,他发明的荧光化合物 fura-2 会随着周围钙离子浓度变化而改变荧光强度,经常被用来研究活体细胞内的钙离子浓度变化。但是这种方法的缺点也很明显:第一荧光化合物可能有毒性,影响正常生理活动;第二把荧光化合物特别是标记了荧光化合物的蛋白注射到细胞内,需要特别的设备和专业训练——微注射;第三即使荧光化合物无毒,也有微注射的条件,每研究一种蛋白,就必须先分离蛋白,然后找到标记荧光化合物的办法。这些困难,限制了普通生物学家研究活体生物活动的能力。 与此同时,分子生物学在PCR技术的发展推动下,已经有了很强的操纵基因的能力。比起蛋白来,在DNA水平上对基因进行裁接和修饰已经是实验室常规操作。如果GFP可以在各个物种中准确折叠发出荧光,那么只要在基因水平上把研究者感兴趣的蛋白基因,接上GFP基因,然后转移到细胞内表达,就等于给被研究的蛋白带上了一个荧光标签。这一切完全不涉及蛋白提纯、标记、蛋白微注射等技术,也就是说,任何一个分子生物学家都有可能用荧光标记自己研究的对象。而且GFP是一种无害无作用的蛋白,不用担心对细胞产生毒性。 尽管野生型GFP发出很绚丽的荧光,但它还是有不少缺点,比如有两个激发峰,光稳定性不好,在37℃不能正确折叠等。此时,钱永健便利用他在活体荧光研究方面的丰富经验,对GFP进行改造,首个重大改变就是钱永健在1995年完成的单点突变(S65T)。这个突变显著提高了GFP的光谱性质,荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488 nm,而发射峰仍保持在509 nm,可与常用的异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocynate,FITC)滤光片匹配,从而提高了GFP的应用潜力。F64L点突变改善了GFP在37℃的折叠能力,在GFP的基础上进行F64L和S65T的突变则形成增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)。EGFP不仅提高了荧光强度,更重要的可以在普通的荧光显微镜下用现有的荧光滤镜进行观察,而且光谱单一,不会和其他荧光染料的光谱发生干扰,更容易观察、检测。 其他的突变还包括颜色突变,而这其中大部分也是钱永健的功劳(图1,见封二)。现在有蓝色荧光蛋白(EBFP,EBFP2,Azurite,