DNA细胞周期检测.pptx

DNA Analysis By Flow Cytometry 核医学生物技术重点实验室 Key lab of Medical College of Su Zhou University 基本原理概述 • 正常人静止体细胞有46条染色体 ， 相当于 7.10-12 pg DNA/细胞核 ， 我们称之为二倍体 细胞 ， 而正常增殖细胞则存在不同的DNA含 量 。在细胞周期(G0 ， G1 ， S ， G2 ，M)的各 个时期 ， DNA的含量随各时相呈现出周期性 的变化： 在G1期 ， 细胞开始RNA和蛋白质的 合成 ， 但DNA含量仍保持二倍体； Key lab of Medical College of Su Zhou University • 进入S期后 ， DNA开始合成 ， 这时细胞核内 DNA的含量介于G1和G2期之间； 当DNA复制 结束成为4倍体时 ， 细胞进入G2期 ， G2期细胞 继续合成RNA及蛋白质 ， 直到进入M期 ， 因此 ， 单纯从DNA含量无法区分G2期和M期； 一旦 有丝分裂发生 ， 细胞分裂成两个子细胞 ， 这两 个子细胞或者进入下一个细胞周期 ， 或者进入 静止期(G0期) ， 而G0期从DNA含量上同样无 法与G1期区分 。 因此 ， 整个复制周期可以描 述为G0/G1 ， S ， G2/M期。 Key lab of Medical College of Su Zhou University • 通过核酸染料标记DNA ， 并由流式细胞仪 进行分析 ， 可以得到细胞各个时期的分布 状态 ， 计算出G0/G1% ， S%及G2/M/% ， 了 解细胞的增殖能力 ， 在肿瘤病理学研究中 ， 通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态 的指标 。正常细胞具有较恒定的DNA含量 ， 而细胞癌变过程中结构和/或染色体的异常 是很常见的 。这种变化在流式分析中以 DNA倍体指数的形式表现出来 ， 这一指数 对于肿瘤的早期诊断 ， 交界瘤、 间叶组织 肿瘤的良恶性判断提供了重要的辅助指标。 Key lab of Medical Su Zhou University College of S合成期 G2/M合成后期及分 裂期 流式DNA周期示意图 G0/G1静止期及合成前期 Key lab of Medical College of Su Zhou University 样本制备 • 来源于血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手 术活检、细针穿刺物等的细胞都可用来做 DNA分析 。新鲜的、冰冻或固定保存的、或 常规固定/包埋用于组织检查的样本均可 。通 常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本 。用组 织切片的好处是可以通过观察常规染色来选 择感兴趣的区域 ， 缺点是不能再用抗体染色 来鉴别肿瘤细胞和正常基质细胞。 Key lab of Medical College of Su Zhou University 实体标本的单细胞制备 • 机械法： 用剪刀、刀片剪切组织或金属网研 磨获取完整的细胞 。但该法获取的细胞数量 少。 • 化学药品处理法： 利用EDTA或Sodium citrate 结合Ca2+或Mg2+等阳离子 ， 破坏细胞间的连 接或用Triton X-100、NP-40破坏细胞膜 。该 法只能取得细胞核 ， 且易出现核凝集。 • 酶法： 利用酶将细胞间的连接物水解 ， 使细 胞从组织中分离出 。一般常用的为胃蛋白酶 及胰蛋白酶 。该法也只能取得细胞核。 College of Su Zhou University Key lab of Medical 细胞浓度及质量要求 • 单细胞和核的最终浓度应约106/ ml 。浓度太 低 ， 上机时样本的流速不得不提高 ， 这样就 会影响检测的CV 。浓度太高 ， 则可能导致染 料的相对不足 ， 最终使染色不饱和 ， 同样影 响CV和检测结果。 • 制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质 量： 细胞是否聚集或过多的碎片； 大多数核 有肿瘤样的外观(比如说 ， 不是粒细胞)等 。 保证足够的肿瘤细胞含量； 检测S%时建议的 最小可接受比例是20%。 Key lab of Medical College of Su Zhou University 固定 • 常用70%的冰酒精固定单细胞悬液 。应保证 样本完全浸没在固定剂中置40C冰箱固定4小 时上。 • 对于甲醛固定的组织切片 ， 应注意甲醛会影 响PI与核酸的结合 。若同时使用抗体鉴别肿 瘤细胞 ， 应选择对抗原无损的固定剂 。对许 多细胞 表面抗原来说 ， 固定只能在抗体标记 之后进行。 Key lab of Med