第四章目的基因的制备、连接、导入与基因文库的构建.pptVIP

先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 先将实验植物材料，例如矮牵牛的叶片进行表面无菌消毒，用经过消毒的无菌不锈钢打孔器从叶片上取下圆形小片，即所谓叶盘，然后接种上含有重组Ti质粒的根瘤土壤杆菌。这种经接种处理的叶盘，在饲养平皿的滤纸上培养2天后，将滤纸连同叶盘转移到含有适量的卡那霉素的“长芽”培养基(shooting emdium)中，进行筛选与再生，接着再转移到“生根培养基”(rooting medium)上诱导幼芽生根，最后将小植株移栽在土壤中 ，叶盘转化法适用性广，对那些能被根瘤土壤杆菌感染的、并能从叶片外植体再生植株的各种植物都可适用。这种方法操作方便简单，获得转基因植株的周期短并具有很高的重复性，便于在实验室内进行大量常规培养。共培养法，是指将毒性的根瘤土壤杆菌，同刚刚再生出新细胞壁的原生质体作短暂的共同培养，以便促使植物细胞发生转化。 将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒;以上述重组农杆菌感染植物细胞。 此法的基本原理是，将包裹着DNA的金粒或钨粒，通过基因枪(gunpowder)、氦气 (helium gas)或电击(electric discharge)等技术来获得足够的加速度，射入完整的植株、组织外植体(tissue explants)、愈伤组织或细胞悬液。 生物弹击法的操作对象可以是完整的细胞或组织，突破了基因转移的物种界限，也不必制备原生质体，实验步骤比较简单易行，具有相当广泛的应用范围，已经成为研究植物细胞转化和培养转基因植物的最有效的手段之一 精子进入卵细胞后，尾部消失，头部变圆膨大，形成雄原核；卵细胞完成第二次有丝分裂后，其细胞形成雌原核。雄原核与雌原核接触，各自的核股消失、融合，二性染色体在其后的台子分裂中混合、配对，受孕宣告结束，一个新生命宣告开始。受精过程约需24小时。 基因文库的构建程序 载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的 l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 l-DNA 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体 通常选质粒 上述几种载体的最大装载量如下： 质粒 考斯质粒 15 kb 25 kb 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb 用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌 本文档共136页；当前第127页；编辑于星期三\15点15分 基因文库的构建程序 从基因文库中筛选目的基因 大型基因组文库一般由数十万甚至上百万个重组克隆组成。除了一些具有特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因、结合蛋白编码基因等）可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤。 本文档共136页；当前第128页；编辑于星期三\15点15分 基因文库的构建程序 从基因文库中筛选目的基因 密集铺板（1-10万） 杂交 挖取 铺板 铺板 目的重组克隆 本文档共136页；当前第129页；编辑于星期三\15点15分 基因文库的构建程序 基因文库构建的技术性问题 在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是： 严禁外源DNA片段之间的连接！！！ 为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 用TdT酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端 本文档共136页；当前第130页；编辑于星期三\15点15分 基因组文库重组克隆的排序 大型基因文