不同钾处理对禾谷镰刀菌后玉米幼根糖代谢及基因表达的影响.docxVIP

不同钾处理对禾谷镰刀菌后玉米幼根糖代谢及基因表达的影响 玉米茎腐病是世界上玉米生产区常见的土壤传播疾病，严重影响了玉米产量。近年来,由于耕作制度(如保护性耕作,秸秆还田等)及气候的影响,茎腐病在我国有逐年加重的趋势。应用化学手段很难完全控制该病,而且会对环境产生负面影响。大量研究表明,合理施用钾肥能增强玉米对茎腐病的抗性,降低发病率,提高玉米产量。关于钾素提高茎腐病抗性的机理已有一些报道,如钾素能通过稳定细胞结构,加厚细胞壁,防止细胞间隙的扩大,来降低病原菌入侵的机率;通过形成位于胞间及胞内的闭塞物来限制病原物在寄主细胞的进一步发展;通过影响玉米根系分泌物的组成来抑制病原菌的生长;通过提高寄主体内酚类物质的含量,调节酚代谢相关酶的活性,提高玉米的抗性。然而,病原菌入侵植物体后,在影响植物次生代谢过程的同时,必定也影响着植物的初生代谢过程。对植物防御反应的研究已有十多年的历史,但关于病原菌对植物初生代谢影响的报道还很少。近年来,对于这个领域的研究逐渐增多,不同类型的病原菌-植物相互作用体系中,糖代谢过程的变化开始被人们所关注。众所周知,钾素作为植物所必需的大量元素之一,与植物体内碳水化合物的合成和转化关系密切;但钾素营养提高玉米茎腐病抗性是否与糖类物质代谢有关尚无明确的报道。 本研究以玉米为试材,通过比较人工接菌后不同钾素处理下,玉米幼根中糖含量,糖代谢关键酶活性及其基因表达的变化,从糖代谢的角度,揭示钾素营养提高玉米茎腐病抗性的机理,为合理施钾控制玉米茎腐病提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 供试病原菌的确定 砂培试验于2006年进行。设4个处理:施钾接菌(+K+F)、施钾不接菌(+K-F)、不施钾接菌(-K+F)和不施钾不接菌(-K-F)。玉米品种为吉单180(抗茎腐病品种)。石英砂作为培养基质,采用Hoagland营养液配方,其中+K处理用5mmol/L KNO3,而-K处理不施K。微量元素参照Arnon营养液配方进行添加。 玉米种子用10%H2O2浸泡20min,再用去离子水清洗,浸泡过夜。将吸水膨胀后的种子置于湿润的纱布上蔽光25℃催芽,露白后于10月26日播种于装有450g石英砂的塑料杯中,第一次浇1/3体积的Hoagland完全营养液。之后按照处理适量浇灌营养液20~30mL/d。置于温室中培养,白天光照12h,白天最高温度25℃,夜间最低温度15℃。接菌处理于12月2日(出苗后35d)进行。供试病原菌为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum),此病菌由吉林省农业科学院环资中心晋齐鸣老师提供。采用根部灌埋禾谷镰刀菌孢子悬浮液(107个/mL)10mL/株。接菌15d后,对根部的发病情况进行调查。 1.2 粗酶提取液principact的制备和分子活性检测 于接菌后0、2、4、6、8d取玉米根系样品,于液氮中速冻后,-80℃保存,待测。并于接菌后8d时,测量株高、根长,及叶片、根及茎秆的鲜重。 糖含量:取0.5g冷冻的幼根用80%酒精提取,氮气下浓缩后,采用高效液相色谱(HPLC)进行测定。仪器:岛津10Avp;色谱条件为:色谱柱,NUCLEODUR 100-5NH2250×4.6mm;流动相,乙腈∶水为80∶20;柱温40℃;流速1mL/min;检测器为示差检测器(RID-10A)。3次重复。 粗酶液的提取:称取新鲜样品1g,液氮中研磨,在4倍体积的Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L,pH 7.0.内含10 mmol/L MgCl2,2 mmol/L ED-TANa2,20mmol/L巯基乙醇,2%乙二醇)中提取,10000r/min,4℃离心20min,取上清液即为粗酶提取液,可同时用于SPS、SS酶活性的测定。酶提取液蛋白含量的测定参照Bradford方法,以牛血清蛋白做标准曲线。 蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性的测定:0.15mL反应体系(含50mmol/L Tris-HCl,pH 7.0;10mmol/LMgCl2;10mmol/LF-6-P;3mmol/LUD-PG)加入一定量的酶液。30℃水浴10min,加入0.02mL 2mol/LNaOH,沸水中煮10min,冷却,再加入2.8mL 30%HCl及0.8mL 0.1%间苯二酚,摇匀,80℃水浴保温10min。冷却,480nm比色,记录OD值,根据标准曲线计算反应中蔗糖形成的数量。 蔗糖合成酶(SS)活性的测定:在SPS反应体系中用10mmol/L果糖取代10mmol/LF-6-P,其余均按SPS的测定方法进行。 sps、ss基因克隆与表达研究方法:分别提取各施钾处理接菌后0、2、4、6、8d及对照处理的玉米幼根中RNA。提取方法参照RNA提取试剂说明书(Takara,Japan)。采用Termentas公司反转录试剂盒,以Ol