第五章目的基因的获取.pptVIP

本文档共74页；当前第30页；编辑于星期三\12点38分 4. 基因组文库的大小 一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目 N= ln (1-p) ln (1-f) p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%） f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数 N:所需的重组载体数（克隆数） 基因文库的大小以及从中获得特定序列的概率的计算公式： 本文档共74页；当前第31页；编辑于星期三\12点38分 例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA片断 的平均长度如果是1.7×104 bp N= ln (1-p) ln (1-f) = ln (1-99%) ln (1-f) = 4.61× G f N= 4.61× G f G:Genome大小；f:fragment大小 N= 4.61× G f = 4.61× 3×109 1.7×104 = 8.1×105 本文档共74页；当前第32页；编辑于星期三\12点38分 本文档共74页；当前第33页；编辑于星期三\12点38分 5. 基因组文库的扩增及保存 （1）基因组文库的扩增 ① 液体培养增殖法 最简便 混合培养方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-80 ℃储存（加终浓度为25%的甘油） 缺点：由于细菌在液体中以混合群体的形式生长和不同克隆生长速率的差异，导致文库中某些特定的序列过多或过少。 本文档共74页；当前第34页；编辑于星期三\12点38分 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中 方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-80 ℃保存。 缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。 本文档共74页；当前第35页；编辑于星期三\12点38分 384孔板 本文档共74页；当前第36页；编辑于星期三\12点38分 ② 影印滤膜培养法 失真最小，最麻烦 用包装后的噬菌体颗粒感染细菌，并让细菌在硝 酸纤维素膜上生长，然后将滤膜上的文库影印到其他滤膜上，以供筛选和低温（-80℃）保存。 ③制备已包装的转导性裂解物 适用于粘粒文库，转导性裂解物可以在低温下长期保存。 本文档共74页；当前第37页；编辑于星期三\12点38分 （2）基因组文库的保存 小包装，方便，避免反复冻融 噬菌体一类的基因文库：密封，加入少许 氯仿，在4 ℃冰箱内可较长时间地保存 （6个月），低温冰箱可保存数年。 本文档共74页；当前第38页；编辑于星期三\12点38分 500kb 50-300kb 本文档共74页；当前第39页；编辑于星期三\12点38分 100-300kb，浓缩产物浓度达到100ng/ul 本文档共74页；当前第40页；编辑于星期三\12点38分 本文档共74页；当前第41页；编辑于星期三\12点38分 本文档共74页；当前第42页；编辑于星期三\12点38分 本文档共74页；当前第43页；编辑于星期三\12点38分 本文档共74页；当前第44页；编辑于星期三\12点38分 本文档共74页；当前第45页；编辑于星期三\12点38分 三、 cDNA文库的构建 cDNA文库：是指某种生物体某一发育时期所转录的 全部的mRNA经反转录形成的cDNA片段 与某种载体连接而形成的克隆的集合。 cDNA文库具有组织细胞特异性，具有时效性。 为什么要构建cDNA文库？ 真核生物的基因组DNA庞大且含有大量的重复序列，难以分离到目的基因片段。 本文档共74页；当前第46页；编辑于星期三\12点38分 1. cDNA 以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反转录酶 引物 2. cDNA文库的特点 （1）不含内含子序列 （2）可以在细菌中直接表达 （3）包含了所有编码蛋白质的基因（时效性） （4）比基因组DNA文库小得多，容易构建 本文档共74页；当前第47页；编辑于星期三\12点38分 3. 构建cDNA文库的一般步骤 本文档共74页；当前第48页；编辑于星期三\12点38分 本文档共74页；当前第49页；编辑于星期三\12点38分 （1）mRNA的来源 特点：多数基因的表达具有不同程度的组织特异 性和发育阶段性。 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等