酶免疫技术课件.pptxVIP

酶免疫技术课件;基本要求;放射免疫技术;第一节 酶免疫技术得特点;主要试剂: 酶标记得抗体或抗原 酶标物特点: 免疫学活性 酶对底物得催化活性;特点: 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其她技术偶联 衍生出适用范围更广得新方法。;标记酶得要求: 活性高 性质稳定 专一性强 酶催化底物得显色信号易于判断和测量 方法敏感,重复性好,简单易行 酶得底物易于配制保存,酶及底物价廉 ;辣根过氧化物酶(HRP) ; 碱性磷酸酶(AP) ;HRP得底物 ;11;HRP得常见底物 ;OPD反应后显橙黄色,加酸终止反应后呈棕黄色,测定波长492nm。不稳定,致癌性。;AP得 底物 ;酶免疫技术得核心组成部分 ;抗原要求纯度高,抗原性完整 ;制备方法要求;制备方法;戊二醛交联法;改良过碘酸钠法: HRP分子中与酶活性无关中得糖蛋白组分,在过碘酸钠作用下,其中得多糖氢基被氧化成活泼得醛基 后者即可与抗体蛋白中得游离氨基交联,再经硼酸化钠还原终止反应,得到稳定得酶标结合物。;纯化及鉴定;固相抗体或抗原就是非均相酶免技术中将游离和结合得酶标记物迅速分离得最常用方法 ;要求 ;将抗原或抗体结合于固相载体;第二节　酶免疫技术分类 ;;用于小分子激素和半抗原(如药物)得测定 ;最具代表性得两种技术;EMIT示意图;CEDIA示意图;分类:液相酶免疫测定 固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体得酶联免疫吸附试验(ELISA) 就是目前最为常用得固相酶免疫测定;第三节　酶联免疫吸附试验 　;;固相得抗原或抗体 ;双抗体夹心法(非竞争结合) 检测含有至少两个抗原决定簇得多价抗原。 利用连接固相载体上得抗体和酶标抗体可分别与样品中被检测抗原分子上两个不同抗原决定簇结合,形成固相抗体－抗原－酶标抗体免疫复合物。;双抗体夹心法 方法:用已知抗体包被,加入待检血清,再加酶标抗体,加底物显色 应用: 二价或二价以上得较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等;;;竞争法 方法:用已知???体包被,加入待测血清,再加酶标抗原,酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用:用于只有一个抗原决定簇得小分子半抗原(药物、激素等);、;;;;;双抗原夹心法 原理:类似双抗体夹心法 操作步骤:类似 应用:乙型肝炎表面抗体;竞争法 原理:类似检测抗原得竞争法 应用:乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)得检测 ;HBcAb竞争法: 核心抗原包被在固相载体上形成固相抗原,加入待测标本和酶标记得特异性核心抗体 此时待测标本中得HBcAb与酶标记HBcAb竞争与核心抗原结合 显色得强弱与待测标本中得HBcAb含量成反比。;HBeAb竞争法: 先将HBeAb包被在固相载体上形成固相抗体,加入待测标本和中和抗原HBeAb 此时待测标本中得HBeAb和固相抗原竞争结合中和抗原HBeAb,待测标本中HBeAb浓度越高,与固相抗体结合得越少 显色得强弱与待测标本中得HBeAb含量成反比。 ;捕获法 应用: 病原体急性感染诊断中得IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体;捕获法 ;;第四节 酶免疫测定得应用;均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质得检测。非均相免疫测定中得ELISA应用更为广泛,ELISA广泛用于传染病得诊断,病毒如病毒性肝炎(甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体)、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等;细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测,如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物(甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等)。;;乙肝病毒表面抗原;;;酶免疫技术就是标记免疫技术得一种,她就是以酶标记得抗原或抗体作为主要试剂得免疫检测方法,在抗原与抗体得特异性反应完成后,通过酶对底物得作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后就是否需要分离结合与游离得酶标记物而分为均相和非均相两种类型。 均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原得测定,非均相酶免疫测定根据就是否使用固相支持物,又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用得就是以聚苯乙烯等材料作为固相载体得酶联免疫吸附试验(EL