Westernblot所需溶液的配制.docVIP

(完整word)Westernblot所需溶液的配制 (完整word)Westernblot所需溶液的配制 (完整word)Westernblot所需溶液的配制 WB所需溶液的配制 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 （Running buffer) 5× Tris base 15.14 Glycine（甘氨酸) 72。0 SDS 5。0 蒸馏水 溶解至1000ml 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15。1g Tris碱和72ｇ甘氨酸,5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。 转膜缓冲液 （Sending buffer）（现用现配） 1000 ml 1500 ml Glycine（甘氨酸） 14。413 g 21。6 1.0 M Tris。HCl （pH8.3） 25 ml 37。5ml 10% SDS 1 ml 1。5 ml 甲醇 (methanol） 200 ml 300 ml 蒸馏水 溶解至1000 ml 溶解至1500 ml 必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。小片段可不加SDS。 10％ SDS配置 电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate ,SDS,C12H25O4NaS）溶液： 10g SDS，100ml去离子水配制,50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存. Tris。HCl的配置 1。0M Tris。HCl (pH8.8） Tris 30。28 g 加入到250ml水中 浓盐酸调pH到8.8 1.5 M Tris.HCl （pH8。8) Tris 45。43 g 加入到250ml水中 浓盐酸调pH到8.8 1.0 M Tris.HCl （pH6.8） Tris 30.28 g 加入到250ml水中 浓盐酸调pH到6。8 1。0 M Tris.HCl （pH8.3) Tris 30.28 g 加入到250ml水中 浓盐酸调pH到8。3,需要大约8毫升。 注：Tris的分子量是121。4。 4度储存。 5 10％ APS (Ammonium persulfate ； 过硫酸铵)的配置 称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml,分装到1。5ml微量离心管中,负30度冻存.使用时尽量现配现用,短期内实验频繁可多配。4度存则两周内用完，最多不能超过一个月.负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。 6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置 NaCl 80 g 160 g Tris base 24 g 48 g 双蒸水 溶解至1000 ml 溶解至2000 ml 加HCl调pH到7.6,室温储存。 TBST (Tris—buffered saline with Tween20） 的配置 10×TBS 100 ml 200 ml Tween20 1 ml 2 ml 双蒸水 溶解至1000 ml 溶解至2000 ml 室温储存。 8 上样缓冲液（loading buffer）的配置 SDS—PAGE加样缓冲液：pH6。8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12。8ml，巯基乙醇3。2ml，0。05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1：2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20—25ul，总蛋白量100μg。 9 stacking gel buffer (4×） Tris base： 0。5M 5 ml 1M Tris.HCl SDS(w/v)： 0.4％ 0.4ml 1％SDS 调pH到6。8，加双蒸水到10毫升. 10 5×Sample buffer （10ml） Stacking gel buffer 5 ml SDS 1。0 g 巯基乙醇 2.5 ml(最后再加) 甘油（glycerol） 2.5 ml 溴芬兰（Sigma B—8026) 2。5 mg 室温储存 封闭液的配置 Blocking solution 要用TBST配制牛奶 5% （w/v） nonfat dried milk 或者1％BSA 0.01％ antifoam A (Sigma） 0。01%（v/v） sodium azide 丽春红溶液： 100微升冰醋酸,加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。 4%多聚甲醛（PFA)的配制 (1000毫升） 40克多聚甲醛，加入800毫升水,60度搅拌溶解,加入300微升氢氧化钠,全部溶解后冷却到4度，再加入100毫升的10×PBS,加水定容到1000毫升。调pH到7.2—7。4。通风橱过滤，4度保存。 13 组织裂解液 10mM