基于斑马鱼模型的药物早期肝毒性快速评价方法.pdfVIP

基于斑马鱼模型的药物早期肝毒性快速评价方法 1 范围 本文件规定了基于斑马鱼模型的药物早期肝毒性快速评价方法的原理、受试物、仪器设备、试验准 备、试验步骤、保证试验有效性的条件、判定步骤、数据处理与试验报告等内容。 本文件适用于基于斑马鱼模型的药物早期肝毒性的快速评价。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 斑马鱼 zebrafish 模式动物的一种，常用于教学和科研。生物分类学上属于脊椎动物门、硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、 斑马鱼属、斑马鱼种。 3.2 Tg （L-FABP:EGFP）品系转基因斑马鱼 Tg （L-FABP:EGFP） strain transgenic zebrafish 实验室常用转基因品系斑马鱼，肝脏被绿色荧光特异标记。 3.3 仔鱼 larva 性腺发育尚未成熟的斑马鱼。 3.4 受精后小时数 hours post-fertilization （hpf） 斑马鱼胚胎体外受精后的小时数。 3.5 没有心跳 lack of heart beat 一分钟内心脏没有跳动。 3.6 药物 drugs 以预防、治疗及诊断疾病的物质。 3.7 10 %致死浓度 10% lethalconcentration （LC ） 10 受试物导致10%受试鱼死亡的浓度。没有心跳判定为死亡。 3.8 荧光显微成像 fluorescence microscopy 对特定样本使用荧光蛋白或分子标记后，对其标记物成像的光学显微成像技术。 3.9 组织切片 tissue slice 以生物组织为材料，处理为薄片，应用于玻片以适合显微镜之观察。 3.10 荧光实时定量聚合酶链式反应 real-time quantitative PCR （RT-qPCR） 在DNA扩增反应中，应用荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。 3 4 方法原理 斑马鱼的肝脏与人类相似，不仅具有分泌胆汁，合成蛋白质的功能，还能中和分解有毒物质。斑马 鱼受精48hpf时，肝脏形态基本形成；受精72hpf后，肝脏的形态及功能全部发育成熟。斑马鱼的肝脏 对药物的介入非常敏感，肝毒性药物极易使其生理结构发生改变，诱导肝脏细胞发生凋亡。综上所述， 以斑马鱼为试验动物，应用荧光显微成像、组织切片和荧光实时定量PCR等技术，以肝脏面积、肝脏组 织形态和凋亡相关基因表达等为检测指标，可对药物的早期肝脏毒性进行快速定量分析。 5 受试物 5.1 受试物配制 5.1.1 水溶性药物：斑马鱼培养水直接溶解配制成检测溶液。 5.1.2 非水溶性药物：选用有机溶剂、乳化剂或分散剂等进行助溶，制备成均匀分散的悬浊液或乳浊 液。 5.2 受试物准备量 5.2.1 固态受试物检测用量10 mg～50 mg。 5.2.2 液态受试物检测用量30 mL～50 mL。 5.2.3 半固态受试物检测用量20 mg～100 mg。 5.2.4 半液态受试物检测用量20 mL～100 mL。 5.3 受试物相关信息 5.3.1 受试物的名称、性状、批号、规格、生产日期、保存条件、保质期。 5.3.2 受试物为单体成分时，还需要提供该成分相应的化学信息，包括分子量、分子式、分子结构。 5.3.3 提供受试物理化性质，包含如下信息： a) 在水中或其它溶剂中的溶解性； b) 在水中和光中的稳定性； c) 温度对受试物稳定性的影响。 6 仪器设备 6.1 分析天平。精度0.0001g。 6.2 量筒。500mL，精度0.5mL 6.3 荧光显微镜。配置蓝色滤光片和图像采集系统，放大倍数为40倍。 6.4 组织切片机。可用于石蜡组织切片的制备。 6.5 RT-qPCR反应仪。内置96孔半导体控温PCR模块；温控精度：≤±0.25℃；温控范围：0℃～99.9℃。 6.6 恒温光照培养箱。精度±1℃。 6.7 斑马鱼养殖系统。配备温控装置，水循环和过滤装置。 6.8 水质监测设备。pH计、溶解氧测定仪、盐度计。 6.9 试验容器