甲基化实验方法和步骤.docxVIP

实战经验: 甲基化检测方法总结一一（亚硫酸氢盐修饰后测序法） 第一部分基因组DNA的提取 这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取 试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA 比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应 该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很 重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2： RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售 RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅 没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。 验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2： 1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA 的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的 修饰。 第一天只需下午半天即可下午3点开始，先配好试剂再开始做实验 III需提前消毒的物品：1.5mlEP管一大盒,双蒸水200ml，15ml III 离心管，开水浴锅, 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用双蒸水稀释至45