蛋白质研究原理与技术n.pptVIP

减少每步操作时间 to avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing recovery 减少添加物 additives may need to be removed in an extra purification step or may interfere with activity assays 早期除去降解物 for example, proteases 每步使用不同的纯化方法 to take advantage of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, hydrophobicity, ligand specificity) KEEP IT SIMPLE! 本文档共159页；当前第94页；编辑于星期六\16点53分 二、蛋白质的性质与功能研究技术 本文档共159页；当前第95页；编辑于星期六\16点53分 蛋白质鉴定 测定蛋白质的浓度 凯氏定氮法 紫外吸收法 分光光度法 测定蛋白质的纯度 鉴定目标蛋白质 蛋白质分子质量与等电点的测定 氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质活性及功能测定 本文档共159页；当前第96页；编辑于星期六\16点53分 1. 蛋白质含量的测定 凯氏定氮法 蛋白质平均含氮量为16﹪；测定氮的含量来估算蛋白含量。 紫外吸收法 芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收，核酸在260nm附近有最大光吸收. 经验公式：蛋白质含量(mg/mL)=1.45× A280 — 0.74A260 分光光度法 蛋白质样品与特定的显色剂反应，反应产物在特定波长的光吸收与蛋白质含量成正比，利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量 考马斯亮兰法等 本文档共159页；当前第97页；编辑于星期六\16点53分 Bradford法 本文档共159页；当前第98页；编辑于星期六\16点53分 2. 纯度鉴定 鉴定方法 电泳纯：在电泳图谱中仅一条电泳条带 色谱纯：在层析图谱中仅一个洗脱峰 结晶纯：可获得蛋白质晶体 相互验证：在某一种鉴定方法下表现为均一的蛋白质在另一种方法可能表现为不均一，因此需要互相验证。 本文档共159页；当前第99页；编辑于星期六\16点53分 色谱纯 电泳纯 结晶纯 本文档共159页；当前第100页；编辑于星期六\16点53分 3.蛋白质鉴定 分子质量及等电点测定（电泳） 氨基酸组成与顺序分析 蛋白质结晶与结构分析 免疫印迹（western-blotting）鉴定★ 本文档共159页；当前第101页；编辑于星期六\16点53分 3.1 氨基酸组成与序列分析 氨基酸组成 水解蛋白质为氨基酸 全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定 顺序分析 质谱法 推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列 化学法（手工、自动） 水解法 Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法 肼解法、羧肽酶法 本文档共159页；当前第102页；编辑于星期六\16点53分 各类氨基酸序列分析仪器 本文档共159页；当前第103页；编辑于星期六\16点53分 3.2 空间结构分析 二级结构的比例 圆二色谱法 三维结构 X射线晶体衍射法—蛋白质晶体 核磁共振—溶液中蛋白质的三维结构 电子显微镜 本文档共159页；当前第104页；编辑于星期六\16点53分 3.3 免疫印迹鉴定 原 理 本文档共159页；当前第105页；编辑于星期六\16点53分 免疫印迹步骤 凝胶电泳 转膜 抗原抗体显色反应 本文档共159页；当前第106页；编辑于星期六\16点53分 STEP 1: SDS本文档共159页；当前第107页；编辑于星期六\16点53分 STEP 2: WESTERN BLOTTING 本文档共159页；当前第108页；编辑于星期六\16点53分 STEP 3: IMMUNE FLURESCENCE EMISSION 本文档共159页；当前第109页；编辑于星期六\16点53分 装 置 电泳槽 转印槽 半干转印槽 浸渍转印槽 本文档共159页；当前第110页；编辑于星期六\16点53分 蛋白质免疫印迹常见问题 本文档共159页；当前第111页；编辑于星期六\16点53分 纹理和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心 蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多 指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却 指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成“三明治”底部有气泡 凝胶时间不对： 凝胶太慢可能是TEMED、 APS剂量不足或失效； 凝胶太快：TEMED、 APS用量过多，胶太硬易裂 SDS常见问题 本文档共159页；当前第112页；编辑于星期六\16点53分