质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题.docx

实验目的： 通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒； 通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的方法和技术； 实验材料及用品 实验仪器（apparatus）： 恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（Vortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（ beaker）、量筒（graduated cylinder）、玻璃棒（stir bar）、 微波炉（microwave）、 天平（Pan balance）、电泳梳子（ comb）、电泳槽 （electrophoresis tank）、 电泳器 （Electro-phoresis System）、 紫外灯（ Ultraviolet transilluminator ） 3）、材料与试剂（Reagents）： ①溶液 I（Solution Ⅰ）： 50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HC（l二胺四乙酸（EDTA） pH8.0  pH8.0）；10mmol/L 乙 溶液 I 可成批配制，每瓶约 100ml，10 磅高压蒸气灭菌 15 分钟，贮存于 4℃。 ②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合 0.2mol/L NaOH（临用前用 10mol/L 贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用 10％贮存液稀释配制）注意：SDS 易产生气泡，不要剧烈搅拌。 ③溶液 III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀 60mL 5mol/L KAc， 11.5mL 冰醋酸， 28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为 3mol/L，醋酸根离子浓度为 5mol/L） ④TE 液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0） ⑤70% 乙醇； ⑥平衡酚：氯仿 1：1： 将量取 25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入 24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后， 移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。 ⑦LB 培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 15g pH 7.0 ⑧琼脂糖（Agarose）； ⑨1 liter（升）5×TBE 备用溶液（stock solution）： 54g tris base，27.5g 硼酸（boric acid），20ml 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0； ⑩6×凝胶加样缓冲液： 0.25% 溴酚蓝（bromophenol blue），40% 蔗糖（sucrose in water）；另外还有的试剂是：胰RNA 酶、DNA Marker、硼酸、Gelview 试剂 实验材料：含有pUC19 质粒的大肠杆菌等。3．实验原理： 质粒DNA 的提取： 关于质粒： 质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的 DNA 分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。 一般分离质粒DNA 的方法都包括 3 个步骤： ①培养细菌，使质粒DNA 大量扩增； ②收集和裂解细菌； ③分离和纯化质粒DNA。 分离制备质粒DNA 的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS 法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA 的用途进行选择。 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA 的原理： 碱裂解法提取质粒DNA 是根据共价闭合环状质粒DNA 和线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。 在 pH 值介于 12.0~12.5 这个狭窄的范围内，线性的 DNA 双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入 pH4.8 乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确；而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质 粒 DNA 恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体 DNA 与不