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蛋白电泳手册 SDS及Western blot 蛋白电泳 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一, 电泳是指带电粒子在电场作用下， 向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳，淀粉凝 胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE）由于无电渗作用,样品 用量少(1-100 μg ）,分辨率高，凝胶机械强度大，重复性好以及可以通过调节单体浓度或单 体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。 PAGE 原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 （简称Acr ）和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis） 在催化剂作用下,聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚 丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产 生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。 SDS—PAGE 原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂,能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子 结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间 天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分 子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS —PAGE）。实验使用过程中，还加入DTT 或者***,以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质的四 级结构。SDS—PAGE 最常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶）。 索引 蛋白电泳（SDS—PAGE）…………………… 电泳试剂总表…………………………………………………… 制胶……………………………… 上样及电泳…………………… 染色 蛋白提取 蛋白定量 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒使用说明 BCA 蛋白浓度测定试剂盒使用说明 Lowry 蛋白浓度测定试剂盒使用说明 蛋白分子量标准（图） 考马斯蛋白胶快速染色液 Western blot Western blotting DAB 检测试剂盒 Western blotting ECL 化学发光检测试剂盒 Western blotting 试剂盒使用说明 蛋白电泳试剂（部分试剂可以相互替换) 系号 货号 名称 1 T8060 TRIS 三羟甲基氨基甲烷 2 G8200 Glycine 甘氨酸 3 S8010 SDS 十二烷基硫酸钠 4 A8080 Acrylamide 丙烯酰胺 5 M8200 N,N—Methylene Bisacrylamid 甲叉双丙烯酰胺 6 A8090 Ammonium Persulfate 过硫酸胺 7 D8220 DTT 二硫苏糖醇 8 M8210 β—Mercaptoethanol β—* ＊* 9 T8090 TEMED 四甲基＊＊＊ 10 A1010 30%丙烯酰胺(29:1 ） 11 S1051 4XSDS分离胶缓冲液（PH=8.8) 12 S1052 4XSDS浓缩胶缓冲液（PH=6.8) 13 P1016 4 ×蛋白上样缓冲液（含β-** ＊) 14 P1015 4 ×蛋白上样缓冲液(含DTT） 15 D1070 1M DTT 16 A1030 10％过硫酸氨 17 T1020 1M Tris—HCL (PH6。8 ） 18 T1010 1。5M Tris-HCL （PH8.8） 19 S1010 10％SDS 20 T1070 5 ×Tris—甘氨酸电泳缓冲液 SDS—PAGE 如今已形成成熟的方案，实验室可根据自己的情况和习惯来选择试剂。如选择1、 2、3、4 、5、6、7、8、9 全部试剂可自己配制。也可以选择配制好的试剂。如10、11、12、 13/14 、16、9、20.还可选择10、13/14 、16、9、17、18、19、20 。 一，制胶 凝胶配制表（一） 分离胶12％ 分离胶10％ 分离胶8 ％ 浓缩胶（3 ％） 总体积 10ml 10ml 10ml 5ml 4X 分离胶缓冲液（PH