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过氧化氢酶Km值的测定杨国栋 Nov2005
一、目的及原理1、目的测定过氧化氢酶的Km值。2、原理①过氧化氢酶的作用？②过氧化氢酶催化的反应？③什么叫Km值？④如何测定过氧化氢酶的Km值？
二、材料与方法1、材料新鲜的绿豆芽。2、方法酶液提取称取新鲜绿豆芽2g，置研钵中，加约少量（约0.2g)碳酸钙和约2mL蒸馏水研成匀浆，转入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容，混匀，静置5min，备用。Km值测定①取三角瓶10个，编号，按照下表加入各种试剂。表④滴定前向各瓶中加入1mL20%KI和3滴（NH4）6MO7O24，用0.02mol/LNa2S2O3滴定至淡黄色时，再加入5滴淀粉指示剂，再用Na2S2O3滴定至蓝色刚消失，记录Na2S2O3消耗总量。
三、结果与分析1、结果滴定的直接数据。2、分析①被分解的H2O2（mg）=[空白滴定值(mL)－样品滴定值(mL)]×c×34.34/2②H2O2酶活性=被分解的H2O2量（mg）×酶液稀释倍数/样品重（g）×时间（min）式中：C为Na2S2O3摩尔浓度34.34为H2O2的摩尔质量③Km值计算：以不同底物浓度为横坐标，以相应酶促反应速度为纵坐标，以双倒数作图法求出H2O2酶的Km及Vmax.
ThankyouEnd
① 过氧化氢酶的作用？过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定联系。生物体内的某些代谢物由于需氧脱氢的结果，而产生对机体有毒害作用的过氧化氢，过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和分子氧，使过氧化氢不致在体内积累，因此，过氧化氢酶具有保护生物机体的作用。return
②过氧化氢酶催化的反应？E+H2O2E-H2O2+AH2E-H2O2+H2O2E-H2O2E+2H2O+AE+2H2O+O2↑过氧化氢酶return
③什么叫Km值？酶促反应的反应速度达到最大反应速度的一半时，所需要的底物浓度即为Km值。return
④ 如何测定过氧化氢酶的Km值？⑤采用双倒数作图法求得Km值。即底物浓度的倒数和在此底物浓度下的酶促反应速度。首先加入过量的H2O2剩余的H2O2用碘量法定量测定，以钼酸铵作催化剂，使H2O2与KI反应，放出游离I2，再用Na2S2O3滴定I2，反应为：H2O2+2KI+H2SO4I2+2Na2S2O3I2+K2SO4+2H2O2NaI+Na2S4O6。[S]return1图13-1双倒数作图法求Km值
return试剂瓶号11’22’33’44’55’酶液（mL）5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.01.8mol/LH2SO4(mL)5.005.005.005.005.00蒸馏水（mL）4.04.03.03.02.02.01.01.0000.05mol/LH2O2(mL)1.01.02.02.03.03.04.04.05.050混匀，室温，准确5min1.8mol/LH2SO4(mL)05.005.005.005.005.020%KI(mL)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0钼酸铵（滴）3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0
[S]1图13-1双倒数作图法求Km值
return试剂瓶号11’22’33’44’55’0.05mol/LH2O2(mL)1.01.02.02.03.03.04.04.05.050加样时间（6:00:00）05:0005:2005:4005:6005:801.8mol/LH2SO4(mL)05.005.005.005.005.0加样时间（6:00:00）10:0010:2010:4010:6010:80
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