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cyp1a1-mspi和aldh-2基因多态性与食管癌发病的关系

与许多肿瘤一样，癌症的发生也是环境因素和遗传因素相互作用的结果。到目前为止，我不知道病因。外来化合物一般不能直接起致癌作用,需经一系列酶系统代谢活化或转化而成为终致癌物后起作用,有的经转化后毒性降低易于排出体外。编码这些酶的某一些基因具有多态性,即具有多个等位基因,不同的等位基因编码的酶活性有差异。代谢酶基因的多态性可使机体清除外源性致癌物的能力有所不同,导致基因的稳定性和细胞的癌变率有所改变,这是决定机体肿瘤易感性的一个重要因素。代谢酶基因多态性与食管癌易感性的研究日渐增多,目前发现的与食管癌易感性相关的代谢酶有细胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽转硫酶(GSTs)、乙醛脱氢酶(ALDH)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)等。为了研究CYP1A1MspI和ALDH-2在当地人群中的分布状态,进而探索其和饮酒习惯相互作用与食管癌高发的关系,本研究在国内首次开展了CYP1A1MspI和ALDH-2联合基因多态性与食管癌易感性关系的研究。

1对象和方法

1.1研究对象的人口学资料及动力学处理

2005年3月～2007年4月在我院收治的食管癌患者160例,年龄(54.38±6.92)岁,病理学确诊均为原发性食管鳞癌或腺癌。对照组160例为健康体检人群,年龄(53.85±3.42)岁,体检显示无肿瘤及遗传性疾病,两组在年龄、性别、民族、籍贯统计学处理差异无显著性,无血缘关系,调查收集研究对象的人口学资料、吸烟史、职业史和家族肿瘤史。饮酒状况由饮酒指数(DI)来估计,DI表示每日饮酒两数×饮酒年数,本文分为不饮酒、DI≤60者和DI60者。每人各抽取静脉血2～3ml,置EDTA抗凝管,分离白细胞层。用QIAampDNA提取试剂盒(德国QIAgen公司)提取白细胞DNA,DNA置-30℃低温冰箱保存备用。两组临床资料见表1。

1.2基因测定

1.2.1pcr扩增及内切酶检测

引物序列5-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3和5-TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT-3,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系总量25μl,包括10×缓冲液2.5μl、1mmol/LdNTP2.5μl、引物各15pmol、TaqDNA聚合酶2.5U、模板DNA2μl,以上试剂购自美国Promega公司。扩增参数:94℃预变性4min,94℃变性40s,55℃退火40s,72℃延伸50s,于美国PE公司PE480PCR仪中循环35次后,72℃延伸7min。取PCR扩增产物5μl于1.5%琼脂糖凝胶中,100V电泳1h,EB染色30min,紫外分析仪观察PCR扩增结果。电泳板琼脂糖由大连宝生物工程有限公司生产。取PCR产物10μl,加入MspI内切酶(大连宝生物公司),酶切反应体系总量30μl,包括PCR产物10μl、10×反应缓冲液2μl、MspI内切酶10U,37℃3h。酶切后产物点样于1.5%琼脂糖凝胶中,100V电泳1h,EB染色30min,分析结果。酶切后分为3种基因型:野生型A(m1/m1)为340bp,杂合型B(m1/m2)为340、200、140bp,突变纯合型C(m2/m2)为200、140bp。见图1。

1.2.2酶切回复突变体utaq酶切酶切鉴定

采用PCR-RFLP引物序列:Y3∶5′-CCCTTTGGTGGCTAGAAGATG-3′,Y4∶5-CCACACTCACAGTTTTCTCTT-3′。扩增片段为91bp。PCR扩增体系为25μl,内含1μlDNA,1μmol/L引物,0.25mmol/L4×dNTP,0.25mmol/LMgCl2,1UTaq酶(购自宝生生物工程有限公司),以及2.5μl10×缓冲液。扩增条件为:95℃预变性10min,然后进行35个循环(95℃1min,58℃2min,72℃1min),最后72℃延伸5min。扩增后取PCR产物3μl,加入5UMboⅡ限制性内切酶(购自宝生生物工程有限公司)及与内切酶相配套使用的10×缓冲液,总量为10μl,37℃消化2.5h。酶切产物的电泳分离与结果判断。取酶切产物8μl,作15%聚丙烯酰胺凝胶电泳,EB染色,紫外灯照射,观察结果。谷氨酸纯合型ALDH1221(G/G)-55bp;谷氨酸赖氨酸杂合型ALDH1?2221?2(G/L)-65bp,55bp;赖氨酸纯合型ALDH2222(L/L)-65bp。见图2。

1.3统计方法

采用SPSS11.0统计软件包进行χ2检验和Logistic回归分析。

2结果

2.1