辣根过氧化物酶标记蛋白的方法.docxVIP

HRP的NaIO4标记法

原理：HRP为一种糖蛋白（glycoprotein）,其所带的糖基上的糖环能被氧化开环，在2,3一位的一C一C一断开。在适当的氧化条件下，2,3一位羟基能被氧化为醛基。醛基在碱性条件下可与被标记物的自由氨基（一NH2）形成Shiff碱（一N=CH—），Shiff碱不稳定，可由逆反应解离。Shiff碱可由还原剂还原成一CH2—NH—，在HRP与被标记物间形成稳定的共价交联°HRP的NaIO4标记法所用氧化剂为NaIO4，还原剂采用NaBH4。

Note:

产物A不稳定，故用NaBH4还原为产物B。

HRP的氧化要适度，氧化不够不能产生足够量的醛基，如氧化过度，醛基可被进一步氧化为羧基，同样也得不到够量的醛基。可通过控制NaIO4的量或控制氧化的时间来调节HRP糖基的氧化度。当糖基的氧化度为20?25%时，有较高的结合效率。

为了防止HRP的过度氧化，在整个标酶的过程中应尽量避光。光照可加快过碘酸钠对HRP糖基的氧化，如在标记过程中不避光，则不可控因素太多。

反应的最后一步用NaBH4来还原的反应比较剧烈，对酶活性的影响比较大。有时可考虑在酶与糖基之间添加一个手臂，如联苯胺反应。

酶量的确定：被标记物在本实验室主要为抗原与抗体。抗原与HRP的比值通常为摩尔比1：1。而抗体与HRP的比值通常为质量比1.6：1。当然，这只是一个基点，可根据需要上下调整比率。统计本次标记所需酶的总量，设为xmg。

酶的氧化（全过程避光，操作中力防污染。酶的终浓度为10mg/mL，总体积为x/10mL）

称取HRPxmg。当HRP从-20°C取出后，一定要平衡到室温，否则HRP冻干品易潮解。称量时不要用称量纸，不要用工具取HRP，应将HRP直接小心地倒入要用来溶解HRP的器具中。在倒HRP时，不要在风口（如电风扇风，自然风，呼吸）操作，因为HRP冻干品质轻易飞扬；尽量不要说话，以防污染°HRP尽量不要回倒，以防污染。当HRP量小于10mg时，溶解器具可用干净Eppendofftube，HRP量大于10mg时，则要求用体积稍大的小玻璃瓶。

加ddH2O（x/20-z）mL溶解（颜色为褐色）。量小可用枪轻轻吹打溶解，量大可用搅拌子适速搅拌溶解。注意不要太剧烈，不要起泡沫，否则HRP易失活。

称取xmgNaIO4，加口ddH,x/20mL溶解（一个原则为NaIO4的量应大于xmg，可先配制成20mg/mL，取适当体积来使用）。

往HRP溶液中逐滴加入NaIO溶液，边加边搅拌。

4

将混合好的溶液置于4C，静置20min（颜色为绿色）。

取xrL乙二醇溶于zmLDDW中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌，z值尽量小，大约为总体积的1/20。

室温静置20min（颜色应回复为最初的褐色）。

酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/mL。

Note:

在酶的活化的过程中，注意NaIO4的浓度，不可太高，氧化时间不能太长，z值尽量的小，活化后的酶要马上使用。活化酶所用的溶解水应为Ulterpurewater。

待标记蛋白的准备及标记（避光。防污染）

样品的处理：蛋白浓度选择最佳浓度（抗体一般要求5mg/mL左右，抗原一般要求1mg/mL左右，蛋白浓度过低可用PEG20000浓缩）。

用pH9.6左右的50mMCB（1XCB）透析去甘油或杂质（如Tris），换液视情况而定。如样品中含有SDS，应在室温下透析去SDS。

（HRP活化的时间应掌握好，以便能与此步接上。一个原则是不能让氧化好的HRP等样品的处理，应HRP一氧化好就可进行此步。）

将蛋白（抗原或抗体）与HRP按所需比例混合，于50mMpH9.5CB中透析6小时以上，头两个小时换液一次。

用新鲜配置的NaBH4溶液终止，NaBH4量为0.2xmg。摇匀，4C静置2小时，每半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适。（NaBH4溶液浓度自定，一个原则是加到透析袋的体积是一个合适的体积。袋子满，所能容纳的体积小，NaBH4可配浓一点，反之亦然。）

用pH8.0的20mMTBS或pH7.2的10mMPBS透析过夜。应换液多次，尽量除去NaBH4

（NaBH4可影响酶联试剂的热稳定性）。如受条件限制，一次也可。

Note:

拿捏透析袋应戴手套。

成品酶的保存：

加等量的甘油，混匀后-20C保存。

附录：

附录1：（标酶过程所用Buffer）

TBS为Tris-HCl等渗缓冲液，PBS为磷酸盐等渗缓冲液，CB为碳酸盐缓冲液。

10X（pH8.020mM）TBS的配制：

20X（pH9.650mM）CB的配制:

20X（pH7.010mM）PBS的配制:

Na2