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附录A异养菌平板计数法

A.1应用

异养菌平板计数法，即标准平板计数法，是测量水中活的异养细菌数目的方法。该方法被应用于饮

用净水的处理以及输配过程中微生物量的检测。成对、成链、丛生的，甚至是单个细胞，均被认定

是一个菌落，这些都被计算在菌落数中。为了进行数据比较，应采用同样的培养步骤和培养基。

A.2环境要求

在一个干净、通风、光线良好的房间或者水平方向通风的罩内，准备无菌操作台或生物安全柜。分

析之前，应对无菌操作台或生物安全柜灭菌处理。

A.3水样

水样采集后尽快进行分析，以减小细菌数量的变化。水样采集与分析之间的最大间隔时间为8h（水

样转移的时间6h，检测时间2h）。如果取样8h内无法进行检测，需将水样置于4℃冷藏，采样和

分析时间间隔不应超过24h。

A.4水样预处理

检测前，需标注水样编号、稀释倍数、日期和其他必要信息。每个水样需要再准备两个平行样。倒

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平板或者灌板时，应采用无菌玻璃片（65cm）或者一次性无菌塑料培养基（57cm）。采用快速的

上下（或前后）颠倒25次的方法将所有的水样或稀释水样进行充分混匀。用振荡器对每个水样震荡

15s。

A.5实验准备

A.5.1实验材料

a)直径4mm，长200mm，从一端40mm处开始弯曲45°的玻璃棒；使用前应经灭菌处理。

b)移液管：1.0mL玻璃或塑料移液管。

c)42℃培养皿或干燥箱，或无菌台。

A.5.2培养基

a)RA培养基：该低营养含量培养基比高营养培养基的产生的菌落数更高。（配方：酵母膏

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0.5g；No.3蛋白胨或多聚蛋白胨0.5g；酪蛋白氨基酸0.5g；葡萄糖0.5g；可溶性淀粉0.5g；

KHPO0.3g，MgSO·7HO0.05g,丙酸钠0.3g，琼脂15g,超纯水1L）。

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b)RA培养基的配置方法是：加入琼脂前，采用KHPO或KHPO将除琼脂以外的成分溶液调节

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pH至7.2，然后加热溶解琼脂，在121℃条件下灭菌15min。

A.5.3培养皿

15mL灭菌培养基置于100×15或90×15的灭菌培养皿中，待琼脂凝固后，将培养皿倒置，进行干

燥处理，这样处理后大约会蒸发掉2g～3g的水分。干燥后的培养皿可以立即使用，也可以在密封塑

料袋4℃保存并在2周内使用。如需干燥后立即使用，可在无菌操作台/生物安全柜中室温下

（24℃～26℃）加25mL培养基于培养皿。

A.6操作流程

A.6.1玻璃棒

移液管移取0.1或0.5mL试样于干燥的培养基表面。用灭菌弯曲玻璃棒（涂布棒），通过用手旋转

培养基将水样均匀涂布于培养皿上，完成接种。待培养基完全吸收菌液后进行培养。

A.6.2移液管

将培养基置于旋转台上旋转，同时用移液管移取适量试样悬于预干燥培养基表面，移液管从中心开

始至距培养皿壁0.5cm止，线性往复运动并缓慢滴加试样。待培养基完全吸收菌液后进行培养。

A.7培养

a)倾倒平板应在35℃下培养48h。否则，应该选择建议的培养时间和温度去检测水质的变化。通

常情况下，在20℃～28℃条件下，培养5d～7d能够得到最大菌落数。

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b)在培养过程中，需要保持培养皿中的湿度，以减少培养基的水分散发。对于长期培养，该步骤

至关重要。可将热水置于培养皿底部，用于保持培养皿温度。为防止培养皿锈蚀，可用塑料膜对培

养皿进行密封来达到保温效果。

A.8计数和记录

A.8.1培养结束后立即对培养皿中菌落数量进行统计。否则，应将培养皿置于5℃～10℃环境下保

存，但保存时间不应超过24h，应避免此类操作。做好每个样品的灭菌控制记录。

A.8.2菌落计数时，应用菌落计数器手动计数。也可使用自动计数设备，但应对自动计数器进行校

正，以保证数