GB_T14933一94小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法(ELISA）.pdfVIP

中华人民共和国国家标准

小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附

GB/T14933一94

测定方法(ELISA)

MethodfordeterminationofT-2toxininwheat

withenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)

1主题内容与适用范围

本标准规定了谷物中T-2毒素的酶联免疫吸附侧定方法(ELISA),

本标准适用于小麦及其制品中T-2毒索的测定。

本方法的最低检出量为1fig/kg,

第一篇间接法

2原理

将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品(含有抗原)提取液

的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原一抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的

抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原一抗体复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催

化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪.测出酶底物的降解量，从而推知被测样

品中的抗原量。

3试剂

本标准所用试剂，凡未指明规格者，均为分析纯，水为蒸馏水或用等纯度的水。

3.1甲醉。

3.2石油醚。

3.3三氯甲烷。

3.4无水乙醇。

3.5乙酸乙酷。

3.6二甲基甲酥胺。

3.7四甲基联苯胺(TMB)

3.8吐温-20.

3.930%过氧化氢00%1-120}).

3.10抗体;杂交瘤细胞系1D7产生的抗T-2毒素的特异性单克隆抗体。

3.11抗原:T-2毒素与载体蛋白一牛血清白蛋白(BSA)的结合物。

3.12兔抗鼠免疫球蛋白与辣根过氧化酶的结合物(酶标二抗)。

3.13ELISA缓冲液系统

3.13.1包被缓冲液为pH9.6的碳酸盆缓冲灌竺趁垂)些9g丝垫旦吵四止三之业卫遇渔邀

中华人民共和国卫生部1994-01一24批准1994一08-01实施

GB/T14933一94

(NaHCO,)，加水稀释至1000mLo

3.13.2洗液为含。.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS-T)配制方法为:

称取磷酸二氢钾(KH,P04)0.2g,磷酸氢二钠(Na,HPO,·12H,0)2.9g,氯化钠(NaCI)8.0g,氯化

钾(K000.2g，吐温-200.5mL，加水至1000mLo

3.13.3底物缓冲液为pH5.。的磷酸一柠檬酸缓冲液，配制方法为:

0.1mol/L柠檬酸(C,He0,-H,0)，即称取柠檬酸19.2g，加水至1000mL，为甲液;

0.2mol/L磷酸氢二钠(Na,HP04)，即称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000mL，为乙液;

取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。

3.13.4底物溶液:取50pLTMB(10mgTMB溶于1mL二甲基甲酞胺中)溶液+10mL底物缓冲液

+10pL30%过氧化氢，混均。

3.14T-2毒素标准溶液

用甲醇配成1mg/mLT-2毒素贮备液,-20℃冰箱贮存。于检测当天，精密吸取贮备液，用20%甲

醇的PBS(配制方法同PBS-T，不加吐温-20即可)稀释成制备标准曲线的所需浓度。

4仪器

所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自来水、蒸馏水冲洗。

4.1酶标检测仪。

4.2酶标板(40孔或96孔)。

4.3电动振荡器。

4.4电热恒温水浴锅。

4.5具0.2mL尾管的10mL小浓缩瓶。

5分析步骤

5.1提取

称取20g粉碎并通过20目筛的样品，置200mL具塞锥形烧瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷

一无水乙醇(4:1),密塞，振荡1h，通过滤纸过滤，取25mL滤液于蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干。

用50mL石油醚分次溶解燕发皿中残渣，洗入250mL分液漏斗中，再用20mL甲醇一水((4:1)分次洗

涤，转入同一分液漏斗中，振摇1.5min，静置约15min，收下层甲醇一水提取液过层析