重组犬血清白蛋白在毕赤酵母中的表达研究.pdf

摘要

摘要

脓毒症、肝硬化、肾病综合症等疾病会引起体内白蛋白水平降低，进而引起低

白蛋白血症（Hypoalbuminemia），及时补充白蛋白后能有效缓解。犬、猫等宠物需

要输注白蛋白时的首要选择往往会是人血清白蛋白，但可能会产生不同程度的超敏

反应，因此使用基因工程技术表达rCSA（recombinantCanineserumalbumin,rCSA）

具有良好的应用前景。

本实验首先在GenBank中查阅CSA（Canineserumalbumin,CSA）氨基酸序列

（登录号为BAC10663.1）进行密码子优化后合成并克隆至pPIC9K载体上，构建

pPIC9K-rCSA重组质粒。将pPIC9K-rCSA重组质粒线性化后电转化至GS115以及X-33

感受态细胞中进行表达，经过SDS鉴定后发现，rCSA在两种菌株中均成功分

泌表达，蛋白大小约为65ku，在X-33菌株中表达量远高于GS115。

其次，为了获得较高的rCSA表达，本实验采用甲醇进行诱导表达并对诱导表达

的温度以及甲醇浓度进行优化，确定了较好的诱导条件为28℃，0.5%甲醇浓度，72

h结束表达。然后对疏水层析介质和阴离子交换层析介质进行筛选，选择效果较好的

Butyl疏水层析和DEAE阴离子交换层析结合的方法对rCSA进行纯化。之后经BCA法

和HPLC检测，纯化后的rCSA的浓度为0.279mg/mL，纯度可达97.91%。

最后选择肝硬化腹水大鼠模型进行rCSA功能的探究，选择20%rHSA以及通过基

因工程表达的rCSA对肝硬化腹水大鼠进行治疗，结果显示经过10%rCSA治疗后，大

鼠体内白蛋白以及胶体渗透压（Colloidosmoticpressure,COP）有一定恢复，但与

大鼠正常水准还有一定差距；20%rCSA治疗后，大鼠体内白蛋白浓度恢复至35.191

g/L，胶体渗透压恢复至23.476mmHg，基本恢复至大鼠正常水平，具有与20%rHSA

一致的治疗效果，且没有出现呕吐、水肿等超敏反应。

本实验基于毕赤酵母体系，对CSA序列进行密码子优化，并对诱导表达的菌株

以及表达条件进行了优化，成功实现了rCSA在毕赤酵母中的分泌表达，对蛋白纯化

层析介质进行筛选，可为rCSA的工业化生产提供一定参考。目前市场上还未有rCSA

应用于犬类疾病的治疗，本实验可以为犬类等动物的治疗提供新的研究思路。

关键词：重组犬血清白蛋白pPIC9K表达载体毕赤酵母蛋白纯化

I

Abstract

Abstract

Diseasessuchassepsis,cirrhosis,andnephroticsyndromecancauseadecreasein

albuminlevelsinthebody,whichinturncauseshypoalbuminemia,itcanbeeffectively

alleviatedbytimelysupplementationofalbumin.Thefirstchoiceforpetssuchasdogsand

catswhoneedalbumininfusionisoftenhumanserumalbumin,butitmayproducedifferent

degreesofhypersensitivity.Therefore,theuseofgeneticengineeringtechnologytoexpress

rCSAhasagoodapplicationprospect.

Inthisstudy,theCSAaminoacidsequence(accessionnumb