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食用蛋白质水解度的改良测定方法

摘要：当制备水解蛋白的时候，测定水解度（DH）是至关重要的。已建立的三硝基苯磺酸（TNBS）发被认为是测定酶水解度的常用方法。然为，三硝基苯磺酸法费时费力，不能连续的测定水解反应程度，并且需要使用有危险不安全的化学试剂。本文阐述了一种基于基本氨基酸与邻苯二甲醛（OPA）反应的水解度测定方法。结论是使用OPA法测定蛋白质的水解度更准确，方便，迅速，有更为广泛的使用范围，并且较之TNBS方法更环保。

关键词：水解度，食用蛋白，水解，蛋白质水解，测定

介绍

在蛋白质水解物当中，检测反应的一个关键参数就是水解度（DH）。DH值呗定义为断开的肽键的百分比：

DH=h/htot*100%

试中htot是每蛋白质当量中肽键总数，h是被水解的肽键数。Htot是取决于原料的氨基酸组成。

在各种文献中，人们已经建立了几种测定蛋白质水解物DH值的方法，例如pH-stat法，渗压法，可溶性氮法以及三硝基苯磺酸（TNBS）法。pH-stat法（Jacobsen等，1957）测定DH值是基于一种基准物（或是由于水解物pH值变化产生的酸）来保持水解过程中的pH值。基准物质的使用量与DH值是成比例的。在实际的蛋白质水解试验中，Ph-stat法的使用仅限于pH略高于7的条件下（Adler-Nissen,1986）。当水解反应的DH值达到约30%时，采用Ph-stat法来测定水解度并不经济可行，在pH7的单一酶反应系统中使用该方法是不可取的。这将使最适pH值低于7的酶不适用Ph-stat法。另外，在水解反应当中添加基准物可能会导致最终产物的使用不尽如人意。

在水解反应当中，混合物冰点的降低值可以通过渗压计（冰点测定器）来测得。这与DH值是相关的（Adler-Nissen,1984）.渗压法是一种可以在多种反应当中使用的快速方法。这种方法的限制之处就在于它不能测定粘度大的溶液及溶质溶解度高的溶液，例如在长期反应当中作为防腐剂的盐。底物中的被夹杂在蛋白酶制剂当中的其他活性物质（如淀粉酵素）水解的非蛋白组分会导致渗压计读数与蛋白质的DH值之间的不相关。

通过测定三氯乙酸（SN-TCA）水溶液中的溶解氮的总量来测定水解度的方法在由Margot等人提出（1994）。他们报道在了胰蛋白酶水解乳清蛋白这一反应当中使用pH-stat法测定水解度的底物消耗量与SN-TCA之间的良好相关性。使用SN-TCA法获得良好试验结果的首要条件似乎是使用内切肽酶。如果反应酶系当中主要是外切肽酶，则会使得试验结果中SN-TCA与通过底物消耗而测定的水解度的相关性降低。这一理论是建立在这样一个事实之上的，即切断相同数量的肽键时，使用外切肽酶所产生的溶解度的增量与使用内切酶时是不同的。作为被切断的肽键的百分比，水解度的测定在参考文献当中没有做出规定。

TNBS法是建立在游离氨基与三硝基苯磺酸（TNBS）试剂的反应的基础上的（Adler-Nissen,1979）。然而该方法也有它的缺点。此法较为费力，不易在水解反应当中快速获得结果以准确反映水解程度。另外，TNBS试剂不稳定，有毒，并且由于有爆炸危险，必须谨慎操作。因此，需要一种无上述缺点的改进方法。

为了给完善中的适当方法提供基础，我们选择了氨基与邻苯二甲醛（OPA）在有6-巯基乙醇存在条件生成可用分光光度计在340nm波长检测的有色化合物之间的反应（图1）。Church等人曾在1983仔细描述过OPA法，他们在每日科学调查当中建议用此法测定牛乳蛋白水解。在我们采用OPA法的实验当中，采用与实验条件更相符的二硫苏糖醇（DTT）代替6-巯基乙醇。

在此方法中的另一个改变之处就是采用丝氨酸作为标准品，因为反应表明，丝氨酸更接近于平均氨基酸。表1当中列出了OPA与氨基酸和短肽反应在340nm处测定的吸光值。该表通过省略与总体平均值相差多于15%的数据来提高准确性。

表1OPA与氨基酸和短肽反应在340nm出吸光值

OD/mmol/100ml

%平均值

甘氨酸

5835*

82

丙氨酸

7156

101

亮氨酸

7310

103

苯丙氨酸

7107

100

丝氨酸

7075

100

半胱氨酸

2311*

33

蛋氨酸

7067

100

色氨酸

6776

96

酪氨酸

7147

101

天冬氨酸

7297

103

天冬酰胺

7808

110

谷氨酸

7646

108

赖氨酸

5814*

82

精氨酸

7451

105

组氨酸

6732

95

N-甘氨酰-甘氨酸

6869

97

N-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸

6099

86

N亮氨酰-蛋氨酸

7240

102

N赖氨酸-苯丙氨酸

7280

103

N-甘氨酰-亮氨酰-酪氨酸

6432

91

平均值

708