氨基酸纸层析.pptVIP

**实验三

氨基酸纸层析

**1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层析的原理和操作技术；2、掌握分配层析法；3、掌握影响分配系数的因素。一、实验目的：**二、定义层析技术是根据被分离的混合物中各组分的理化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中进行分配。层析的基本概念**固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。层析的基本概念**三、层析技术的种类1、按流动相的状态分类：（1）液相层析（色谱）（2）气相层析（色谱）；2、按固定相的使用形式分类：（1）柱层析（2）纸层析（3）薄层层析；3、按分离过程所主要依据的物理化学性质分类：（1）吸附层析（2）分配层析（3）离子交换层析（4）凝胶层析（5）亲和层析等。**纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点不等的层析点二、实验原理:**分配层析法：利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数α是一个常数。溶质在固定相的浓度(Cs)分配系数α=溶质在流动相的浓度（Cl)**溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2固定相：水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相;流动相：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。由于混合液中各种氨基酸的α值不同，所以移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。**移动速率(比移值)：原点到层析点中心的距离Rf=原点到溶剂前沿的距离**影响Rf值的主要因素：Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物质分配系数不同，Rf也就不同。**1、实验材料：谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品2、仪器：(1)毛细管(2)电热吹风机(3)层析缸(4)层析滤纸(5)小型玻璃喷雾器(6)铅笔、直尺等。3、试剂：(1)氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、组氨酸标准品。(2)溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；(3)显色剂：0.25%的茚三酮丙酮溶液。三、实验材料、仪器和试剂：**1、样品的准备：称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各1mg混合溶于10%异丙醇中，0.01M。2、滤纸的准备：取一长方形滤纸，在滤纸横向对应的两边，距边沿2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个“+”作为点样位置，共5个点。四、实验步骤：****3、点样：用毛细管点样，中间点混合氨基酸，两侧点四种标准氨基酸；每个，每点一次用晾干后再点下次，点样点的直径应控制在2mm左点样点重复点5次右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外。**卷成筒状的滤纸氨基酸显色后的图谱溶剂前沿XY**4、展层：向层析缸中加入层析溶剂，液面不要超过点样线，（高约1.5cm，约50ml溶剂）将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出冷风吹干。5、显色：用喷雾器将0.25％茚三酮显色剂均