柱离心法小量提取质粒DNA及DNA的琼脂糖凝胶电泳.docxVIP

柱离心法小量提取质粒DNA及DNA的琼脂糖凝胶电泳

实验目的和要求：

1、了解质粒DNA的应用，并学习用柱离心法小量提取质粒DNA。

2、掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的方法。

实验原理：

质粒是细菌中独立于染色体之外的较小的环状双链DNA，它通常携带某种药物（如氨苄青霉素，卡那霉素，链霉素，四环素等）的抗性基因，具有独立的复制原点，并且具有较高的拷贝数（从几个到几百个不等）。

柱离心法首先用碱使大肠杆菌裂解，并使其中的DNA（包括质粒及细菌的染色体DNA）全部变性。再用酸性缓冲液中和，质粒DNA由于分子较小，很快复性，而染色体DNA分子巨大，几乎不能复性，最后和细胞碎片及膜蛋白共沉淀被离心去除，上清液中含有复性的质粒DNA，蛋白质，RNA，并且盐浓度较高。在这种条件下，质粒DNA能够牢固地结合在离心柱中的吸附基质上，而大多数蛋白质和RNA在离心时被穿过，残留在吸附基质上的少量蛋白质和RNA可以用漂洗液洗去，最后，吸附在离心柱上的质粒DNA用低离子强度的溶液或水洗脱。

与蛋白质相比，DNA的分子量通常要大得多，必须用孔径较大的琼脂糖凝胶介质进行分离。

在理想的电泳条件下，具有相同构型的DNA的电泳迁移率和它们分子量的对数成线性关系，分子量相同的质粒DNA的电泳迁移率和它们的构型有关，由快到慢通常为超螺旋，线性，开环和复制中间体（连环体）。

DNA限制性内切酶可以从内部切割环状或线状双链D