原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
1．GUS报告基因的定性检测
GUS能与显色底物X-gluc?反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性研究GUS的表达水平和表达模式。GUS?染色的稳定性好，组织定位精确，成为在植物中运用很广的报道基因。
1.1GUS染色底物的配制
按下表1配制GUS染色的底物。
表1.GUS染色底物的配制
试剂名称
母液浓度
母液配制方法
工作液浓度
工作液配制方法
磷酸缓冲液（pH7.2）
0.5M
将0.5MNa2HPO4?和0.5MNaH2PO4?混合*
50mM
1ml
?
TritonX-100
10%
取10mlTritonX-100溶于水，定容至100ml。
0.1%
0.1ml
铁氰化钾K3Fe(CN)6
100mM
将3.2924g铁氰化钾溶于水，定容至100ml。
2mM
0.2ml
亚铁氰化钾
K4[Fe(CN)6]?·3H2O
100mM
?
将4.2239g亚铁氰化钾溶于水，定容至100ml。
2mM
0.2ml
EDTA
0.5M
?
将18.61gNa2EDTA·2H20溶于水，调pH为8.0，定容至100ml水。
10mM
0.2ml
X-Gluc
/
?
2mM
10.4mg
ddH2O
/
/
?
定容至10ml
*0.5MNa2HPO4配制方法：将17.907gNa2HPO4溶于水，定容至100ml。0.5MNaH2PO4的配制方法：将7.800gNaH2PO4溶于水，定容至100ml。
?
1.2?染色步骤
1)???染色：加入适量配制好的GUS?染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6h
2)???漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。
3)???脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。
4)???记录：在体视显微镜下拍照记录。
2．GUS报导基因的定量检测
GUS?能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。MU的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，我们可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。
2.1?试剂配制
1)???1mol/LNa2HPO4溶液：35.814gNa2HPO4溶于100ml水。
2)???1mol/LNaH2PO4?溶液：15.601gNaH2PO4?溶于100ml水。
3)???0.1M?磷酸缓冲液(PH7.0)：1mol/LNa2HPO4取5.77ml，1mol/LNaH2PO4取4.23ml，定容至100ml。
4)???10％?SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10gSDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节PH至7.2，然后加水定容至100ml。
5)???0.5MEDTA(PH8.0)：在80ml水中加入18.61gNa2EDTA?2H2O，用NaOH调PH至8.0（约需2g左右的固体NaOH），溶解后定容至100ml。
6)???GUS酶提取液：0.1M?磷酸缓冲液（PH7.0）取50ml；10%SDS取1ml；?0.5MEDTA(PH8.0)取2ml；TritonX-100取100ul；β-巯基乙醇100ul；用水定容至100ml。
7)???MUG底物：称8.8mgMUG，溶于10mlGUS酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。
8)???反应终止液（0.2mol/LNa2CO3?）：称2.12Na2CO3?，用水定容到100ml。
9)???考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G25010mg,95%乙醇5m1,H3PO4?10ml，定容至l00ml，过滤后4℃
10)?１mg/mlBSA：20mgBSA，用GUS提取缓冲液定容至20ml。
2.2?植物总蛋白的提取
1)???取新鲜的植物组织100mg左右，用液氮将生物材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里磨碎组织。如果不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80℃
2)???将研磨破碎的组织转到Ep管里，并立即加入1ml的GUS提取缓冲液，充分混匀。
3)???12,000rpm,4℃离心5min，将上清转至另一洁净的Ep
2.3?蛋白浓度的测定（Bradford法）
1)???取7个Ep管，分别加入0μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl的BSA标准液，用水补至相同体积20μl。加入980μl的考马斯亮蓝G250溶液
文档评论（0）