蛋白质的性质与分离、分析技术.pptxVIP

蛋白质是由氨基酸组成的高分子有机化合物，因此其性质必定有一部分与氨基酸相同或相关，例如两性解离及等电点、紫外吸收性质、呈色反应等等。但是，蛋白质作为高分子化合物，它又表现出与低分子化合物有根本区别的大分子特性，如胶体性、变性和免疫学特性等。;（1）蛋白质的分子量;（1）蛋白质的分子量;（1）蛋白质的分子量;（1）蛋白质的分子量;测出的是亚基的Mr，若待测蛋白质是多亚基的，则需配合使用凝胶过滤法确定整个分子的Mr;（2）蛋白质的两性电离与等电点;（2）蛋白质的两性电离与等电点;（2）蛋白质的两性电离与等电点;（2）蛋白质的两性电离与等电点;蛋白质高分子特性形成了复杂而特定的空间构象，表现出特异的生物学功能。某些物理和化学因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变，这种现象称为蛋白质的变性作用(denaturation);次级键破坏(本质)，一级结构不变，组成成分和Mr不变

生物活性丢失（最主要的特征）

酶-催化能力、血红蛋白-氧运输、胰岛素-降血糖

理化性质改变

基团暴露

疏水基团→溶解度↓→沉淀析出←肽链松散，相互缠绕

反应基团（-SH、-S-S-基、酚羟基等）

结晶能力丧失

球状蛋白质分子形状发生改变;RNase的变性和复性实验;蛋白质的性质与分离、分析技术;蛋白质的性质与分离、分析技术;（4）蛋白质的胶体性质;电荷+水膜→胶体;（5）蛋白质的沉淀;有机溶剂：乙醇、丙酮等破坏蛋白质分子周围的水膜

低温条件下，蛋白质一般不变性，沉淀效果优于盐析

pI条件下效果更好;加某些酸类：苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质形成不溶解的盐

蛋白质变性，常用除去样品蛋白质杂质;（6）蛋白质的颜色反应;（7）蛋白质含量的测定;（7）蛋白质含量的测定;（7）蛋白质含量的测定;（7）蛋白质含量的测定;免疫学方法(抗原-抗体特异结合)与荧光标记技术相结合，用于研究特异蛋白抗原在细胞内的含量和分布

直接免疫荧光技术(A)：荧光分子与抗体偶联后直接用于免疫标记

间接免疫荧光技术(B)：先将抗体(一抗)与抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联的抗第一抗体的抗体(二抗);在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位

分类：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术、免疫胶体金技术;蛋白质的性质与分离、分析技术;（1）根据蛋白质溶解度不同进行分离;盐析：中性盐(硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠)

硫酸铵分段盐析效果较优，不易引起蛋白质变性

沉淀分离后需除盐

a、透析法：蛋白质溶液装入透析袋内(玻璃纸)，用缓冲液进行透析，不断更换缓冲液(时间长，低温进行)

b、柱层析：葡聚糖凝胶G-25或G-50;等电点沉淀法：等电点状态时颗粒之间的静电斥力最小，溶解度最小，各蛋白质等电点不同，调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀;（2）根据蛋白质分子大小进行分离;（2）根据蛋白质分子大小进行分离;（3）根据蛋白质带电性质进行分离;（3）根据蛋白质带电性质进行分离;（3）根据蛋白质带电性质进行分离;（3）根据蛋白质带电性质进行分离;（4）根据配体特异性进行分离