目的基因的制备.pptVIP

**********************************************************************************YAC基因组文库的构建过程脉冲电场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)第55页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三1基因组DNA片断化2PCR技术扩增目的基因3化学合成基因4基因文库技术获取目的基因基因组文库的构建cDNA文库的构建目的基因的获取第56页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三4.2cDNA基因文库的构建及目的基因分离4.2.1cDNA基因文库的概念cDNA文库：是指某生物基因组转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。4.2.2cDNA基因文库的构建4.2.3mRNA丰度与cDNA基因文库大小的关系4.2.4cDNA克隆的优越性第57页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三4.2.2cDNA基因文库的构建主要步骤：①从生物体或细胞中提取mRNA；②利用逆转录酶合成cDNA的第一条链；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链，④cDNA与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。第58页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三mRNA的提取全长mRNA具有一个polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分离；用寡聚纤维素柱，选择性地吸附mRNA纯化第59页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三①分离细胞总RNA，从中分离纯化mRNA；②合成cDNA的第一条链：?a.oligo(dT)引导的DNA合成法：原理：真核mRNA分子具有poly(A)尾巴，加入oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。缺陷：逆转录酶通常无法到达mRNA分子的5’-末端，必须从3’-末端开始合成cDNA。第60页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三b.随机引物引导的cDNA合成法：原理：随机引物：人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸片段杂交，并作为聚合酶反应的引物。应用这种混合引物，cDNA的合成从mRNA模板的许多位点同时发生，从而保证得到mRNA的编码区和5’端旁侧。多用于mRNA分子较大且3’端非编码区序列较长；AAAAAAAAAAAA3’5’3’第61页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三4.2.2cDNA基因文库的构建主要步骤：①从生物体或细胞中提取mRNA；②利用逆转录酶合成cDNA的第一条链；③利用DNA聚合酶，以cDNA第一条链作为模板，用适当引物合成cDNA第二条链，④cDNA与载体的重组后导入大肠杆菌宿主细胞增值。第62页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三③合成cDNA第二条链a.自身引导合成法b.大肠杆菌RNaseH酶降解取代法c.oligo(dG)寡聚引物引导法d.PCR法第63页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三a.自身引导合成法：原理：单链cDNA的3’端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I、Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。缺点：S1核酸酶切割发夹状结构会丢失对应于mRNA5’端的序列。S1核酸酶偶尔破坏合成的双链cDNA分子。第64页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三b.大肠杆菌RNaseH酶降解取代法-置换合成法原理：以第一链合成产物cDNA-mRNA作为切口平移的模板，RNA酶H对mRNA造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。第65页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三优点：a）合成cDNA的效率高b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA第66页，讲稿共83页，2023年5月2日，星期三c.oligo(dG)寡聚引物引导法oligo(dG)作为引物可与cDNA第一链3’末端的poly(C)序列相结合，有效的引发