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4、微生物诊断病料采集：立克次氏体分离培养的病料，应采自未用抗生素的急性期或发热期患病动物，已死亡的动物应尽早采集。病料-70℃保存。根据需要可采取急性期或发热期患病动物的血液；病死动物的脾、肝、肾、脑、脊髓及胎盘、乳汁等。第62页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三病原检查分离将所采病料制成血片或组织抹片，经适当方法染色后镜检。或将病料处理后接种于鸡胚卵黄囊内或适宜的易感动物或接种细胞，培养出立克次体。抗体检查可用已知抗原作凝集试验、补体结合试验或中和试验，以证实患病动物血清中的相应抗体，从而诊断该病。中和试验可用豚鼠或鸡胚进行。由于某些变形杆菌菌株可与某些立克次体多糖抗原的抗体发生交叉反应，故在医学上，常用这些变形杆菌菌株制成凝集抗原，用凝集试验检查某些立克次体病。这种凝集试验称为魏-裴二氏反应第63页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三三、支原体1、形态结构及染色特性支原体是目前发现的最小的最简单的，也是唯一一种没有细胞壁的原核细胞，细胞柔软具有高度的多形性。常呈球形、杆状和丝状，偶见有梨状、分枝状、环状、螺旋状等不规则的形状。支原体的大小为0.2～0.3um,可通过滤菌器革兰氏染色呈阴性，通常着色效果不好，故常用姬姆萨染色染色法将其染成淡紫色第64页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三2、生物学特性支原体基因组为一环状以双链DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的五分之一）支原体的生物合成能力较弱，虽然能够在人工培养基上生长，但营养要求比一般细菌高，常常需要在培养基中加入胆固醇、血清、腹水、牛肉浸膏和酵母浸汁等特殊成分。对环境渗透压敏感第65页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三3、致病性与免疫性除了少数的支原体为腐生或共生菌，大多数为寄生菌。病原性支原体常常定居于多种动物的呼吸道、泌尿生殖道、消化道黏膜表面、乳腺以及眼等部位，并且对胸腺、腹膜、关节滑液囊膜的间质细胞以及中枢神经系统的亲和力较强。第66页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三4、微生物学诊断直接镜检意义十分有限，应该取病料进行分离培养和形态学检验，做生理生化以及血清学试验方能进行鉴定。第67页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三（1）病料采集和保存由于支原体侵害动物的黏膜表面，一般可用灭菌棉花拭子涂抹取样。也可根据病变部位，取其肺、胸水、乳汁、鼻咽分泌物、关节液、淋巴结等，病料可经滤器除菌后再接种。第68页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三（2）培养方法培养基中培养鸡胚接种培养动物接种培养第69页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三（3）菌落形态和染色观察支原体在适宜的固体培养基上能长出具有“油煎蛋状”或“桑葚状”菌落肺炎支原体菌落第70页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三电子显微镜镜下肺炎支原体呈现多型性第71页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三三、病料的记录、包装和运送1、送检样品的记录送往实验室的样品应有一式三份的送检报告，一份随样品送实验室，一份随后寄去，另一份备案2、送检样品包装和运送所采集的样品以最快最直接的途径送往实验室。24h内的放在4℃左右的容器中运送。24h内不能运送的，把样品冷冻，并以此状态运送第30页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三四、病料的处理1、性状观察采集的病料，在接种培养前,应对其性状进行观察，如是否脓性带血或腐败，有何异味,并作记录2、涂片各种病料在分离培养前均应制备涂片,作革兰氏染色,镜检,以了解细菌的形态,染色特性,并大致估计其含菌量。通过肉眼观察和显微镜下看到的结果,对病料中可能含有的病原菌作最初步的估价。第31页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三3、污染病料抑菌培养如果病料被杂菌污染严重,则需采用一些对病原菌无害,但对杂菌有杀灭或抑制作用的方法,以抑制杂菌生长。4、集菌处理有些病料含菌太少,则应先作集菌处理,然后接种,以提高检出率,其集菌方法有离心法和过滤法.第32页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三第二节细菌分离及鉴定一、细菌的分离与接种1、平板划线接种法通过平板划线后,可使细菌分散生长,形成单个菌落,有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。第33页，讲稿共101页，2023年5月2日，星期三A分区划线法首先将接种环灭菌后,沾取标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分(第一区),将接种环火焰灭菌,待冷却后只通过第一区3-4次后连续划线(为第二区),依次可共划线3-5区,每一区细菌