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免疫荧光染色方法

选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。

除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原一抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20°C下可保存一年而不改变其染色特性。

标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质;

③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。

常用抗原物质的固定方法

抗原物质

固定剂

固定条件

(min)

蛋白质抗原

95%?100%乙醇

室温3?10

酶、激素

丙酮

4C 30

免疫球蛋白

四氯化碳

病毒

丙酮、四氯化碳、无水乙醇

室温5?10

或

4C30?60

多糖、细菌等

微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮

室温5?10或4C30?60

类脂(异嗜性抗原)10%甲醛，10%

类脂(异嗜性抗原)

10%甲醛，10%佛茂尔

(ForMol)

室温3?10

固定后以冷的0?01Mol/LpH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲

洗，防止自发性荧光。

染色分直接染色法与间接染色法。

材料与试剂

荧光抗体，稀释至应用浓度。

0.01Mol/LpH7.4PBS液

9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。

带盖方盘

2.直接染色法

将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖

为度，加盖，37°C感做30min?45min。

PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即33，冲洗。

蒸馏水冲洗。

滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。

间接染色法

(1)检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37C孵育

30min；②以PBS液3x3,冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37C孵育

30min；④PBS3x3冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。

(2)检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定;②滴加相应抗原液(按1:100~1:500稀释),37°C孵育30min；

③PBS液3乂3，冲洗；④加荧光抗体，37C孵育30min:⑤PBS液3x3冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。

荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。

荧光强度的表示方法如下：

+++?++++:荧光闪亮，呈明显的亮绿色。

++:荧光明亮，呈黄绿色。

+:荧光较弱，但清楚可见。

士：极弱的可疑荧光。

—:无荧光。

由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。

保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随

染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂(Fluormount)或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。

荧光原位杂交(FISH)实验步骤

1/医用微波炉；

2、 水浴锅；

3、 OLYMPUSBX51荧光显微镜；

4、 OLYMPUSDP11数字显微照相机。

皿，试剂

(1)1XPBS：由10XPBS溶液稀释而成，储存于4°C；

20xSSC(pH7.0)；

2xSSC，由20xSSC溶液稀释而成；

25mg/ml蛋白酶K消化液。

变性液(70%甲酰胺+2xSSC,pH7.0)：4ml20xSSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。

杂交后洗涤液：20xSSC4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。

1、 脱蜡：

1） 二甲苯脱蜡3次，每次5min；

2） 100%酒精两次，每次2min；

3） 移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

2、 蛋白酶处理：

1） 每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下:2xSSC40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2） 37°C水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37°C孵育

20min。

3） xSSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4） 梯度酒精脱水（-20C预冷）。

3、 变性：

1） 每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；

2） 78C水浴槽中平衡预热混