免疫组化实验方案.docxVIP

鼠脑组织ICH实验操作步骤

所用试剂及耗材

一抗：Anti-TyrosineHydroxylase,cloneLNC1.Millipore.Cat.#MAB318.Lot#NG1899912.

二抗：EnvisionTMDetectionKit.GeneTech(Shanghai)CompanyLimited.CodeNo:GK500705/10.

一抗稀释液：免疫染色一抗稀释液。碧云天生物技术研究所。CodeNo：P0103。

PBS：PBS缓冲液(PH7.2-7.6)。武汉博士德生物工程有限公司。CodeNo：AR0030

枸橼酸盐缓冲液：PH6.0。武汉博士德生物工程有限公司。CodeNo：AR0024

H2O2：3%(PBS配置)

病理载玻片、病理盖玻片、免疫组化湿盒、免疫组化笔、切片盒、晾片板。

免疫组化

二甲苯脱蜡透明：每次10min，连续2次。

梯度乙醇洗脱：100%浓度洗脱5min，100%、95%、95%浓度洗脱2min，然后用去离子水冲洗。

抗原修复：用去离子水冲洗切片，然后将组织放入枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)中，使用微波炉加热，先高火5min，然后中低火10min。修复后自然冷却到室温。

4） PBS洗片：修复后的切片使用PBS冲洗，每次3min,连续3次。

5） 3%H2O2（PBS配置）封闭：避光孵育10min,去离子水冲洗。

6） PBS洗片：每次3min，连续3次。

7） 封闭：用滤纸擦干切片组织周围的水，用免疫组化笔画圈。然后滴加

10%血清（PBS配置）封闭非特异性作用位点，每张载玻片加200叫到300^l封闭液，室温孵育1h。

8） 一抗（1:1000）孵育：封闭后的切片，用移液器吸掉封闭液，然后每张切片滴加200m的一抗（抗体使用一抗稀释液稀释到所需浓度），湿盒中室温孵育1h。

9） PBS洗片：使用移液器吸掉一抗，然后用PBS洗片，每次3min，连续3次。

10） 二抗孵育：直接使用试剂盒中的二抗滴加到组织上，每个组织滴加一滴，湿盒中室温孵育30min。

11） PBS洗片：使用移液器吸掉二抗，然后用PBS洗片，每次3min，连续3次。

12） DAB染色（试剂B：试剂C=50:1）：每张切片加200侃的DAB染色液，室温染色5min，去离子水冲洗。

13） 苏木素复染：复染1min，去离子水冲洗。

14） 梯度酒精水化：酒精浓度从95%、95%、100%、100%逐步水化，每次

2min。

15） 二甲苯透明：每次5min，连续2次。

16） 中性树胶封片，显微镜观察。（封片可干封也可湿封，湿封即浸泡完二甲苯II之后不晾干，切片从二甲苯中捞出后迅速滴加树脂盖上盖玻片）。

各种液体配制方法

抗原修复液中涉及到的液体：

A液——枸橼酸（柠檬酸）5.2525g+双蒸水250ml（易长毛，长毛后需重配）

B液一一枸橼酸钠（柠檬酸钠）14.705g+双蒸水500ml。

抗原修复液——A液4.5ml+B液20.5ml+双蒸水225ml。

3%双氧水 90ml双蒸水+30%双氧水10ml。

DAB显色剂（配制时请关灯避光）一一1ml双蒸馏水加入DAB显色试剂盒中的A液一滴后混匀，再加入B液、C液各一滴混匀即刻，避光保存，30min内使用。