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埃博拉病毒核酸检测方法

一、目的

埃博拉病毒核酸的提取及PCR检测。

二、适用范围

适用于检测血标本中埃博拉病毒核酸。

三、实验前准备

核对被检样品，包括患者的姓名、编号及检测项目等。

四、检测仪器设备和材料

实时定量核酸扩增检测仪，常规核酸扩增检测仪，RNA提取试剂盒，一步法RT-PCR扩增试剂盒，一步法实时定量RT-PCR扩

增试剂盒等。

五、实验步骤

(一)实验准备

1.埃博拉病毒相关感染性材料灭活要求在BSL-3级实验室生物安全柜内操作，灭活材料的核酸提取可在BSL-2级实验室内

进行，核酸PCR扩增可在BSL-1级实验室内进行。

2.进入实验场所之前，要事先准备好所需试剂、样品。预约

实验场所。

(二)RNA的提取(两种方法，可选任一方法进行核酸提取)

RNA提取方法一(5.2.1～5.2.3)

使用TRIzol(或TriPure)试剂以及QIAampViralRNAMini

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试剂盒提取血标本中病毒RNA。

1.试剂准备：

a.TRIzol(或TriPure)试剂避光保存于2-25℃。QIAamp

ViralRNAMini试剂盒室温(15～25℃)保存；

b.96～100%无水乙醇；

c.1.5ml离心管；

d.带滤芯的灭菌无RNase的移液枪头；

e.台式离心机(适用于1.5ml离心管的转头);

f.缓冲液AW1和AW2在第一次使用前要按照试剂盒说明书加

入适量无水乙醇稀释；

g.加入310μlAVE至冻干的CarrierRNA中，充分溶解后分

装保存于-20℃,每份分装保存的CarrierRNA不能冻融超过三次。

2.埃博拉病毒相关感染性标本灭活，应在BSL-3实验室Ⅱ级

生物安全柜内进行。

a.吸取700μlTRIzol(或TriPure)至带螺旋口的离心管中，

每管加入5.6μlCarrierRNA。

b.向上述的裂解液中加入70μ1样品，盖好盖后，轻轻的上下颠倒混匀10次，室温孵育不少于10分钟(为避免产生气溶胶，

不要使用震荡仪或摇动离心管混匀)。

c.将管浸入消毒液中3～5分钟，彻底消毒管外壁，然后擦干净，简单离心使离心管顶端液体落到底部。如需将灭活样本转运至BSL-2实验室进行病毒RNA提取，将样本裂解液转移至新管中，颠倒10次以保证管内部充分灭活，然后将裂解样本管浸入消毒液

中3～5分钟，彻底消毒管外壁，然后擦干净，将裂解样本管放入防

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漏保存装置中，可将管移出生物安全柜进行转运或冻存。6小时内可在2～8℃保存，6小时以上至2周可在-20℃保存，超过2

周需在-80℃保存，应避免反复冻融。

3.RNA提取，可在BSL-2实验室内进行。

a.在裂解样本管内加入620μ196～100%的乙醇，轻轻的

上下颠倒混匀10次，再简单离心。

b.小心将700μ1液体加入QIAampMiniSpinColumn中，盖好盖，8000rpm/min离心1min,弃去收集管，将柱子置于一新的

2ml收集管上。

c.打开QIAampMiniSpinColumn的盖子，重复步骤5.2.3b,

直至完成全部样品离心。

d.打开盖子，向柱中加入500μ1AW1缓冲液，盖好盖，8000rpm/min离心1min,弃去收集管，将柱子置于一新的2ml收

集管上。

e.打开盖子，加入500μlAW2缓冲液，盖好盖，14000rpm/min

离心3min。

f.将柱子置于一新的2ml收集管上，空离1min。

g.将柱子置于一新的1.5ml离心管上，加入50μlAVE洗脱缓冲液，室温孵育1min,8000rpm/min离心1min。离心液即为病

毒RNA,立即检测或-80℃保存。

RNA的提取方法二(5.2.4～5.2.5,美国CDC推荐方法)

4.埃博拉病毒相关感染性标本灭活，应在BSL-3实验室Ⅱ级

生物安全柜内进行。

a.在带有螺旋口的离心管中，将样本与TriPure(或TRIzol)

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试剂按照1:10的体积比加入(通常为将50μl标本加入500μl

TriPure中或将100μ1标本加入1000μlTriPure中)。

b.上下颠倒混匀10次使液体充分混匀室温放置至少10min,

为避免产生气溶胶，不要使用震荡仪或摇动离心管。

c.将样本裂解液转移至新管中，颠倒10次以保证管内部充分

灭活。

d.将管浸入消毒液中，彻底消毒管外壁，然后擦拭干净，放入防漏保存装