实训项目十五内标对比法测定对乙酰氨基酚的含量.docxVIP

ci试样

c

i试样= i对照×

c

掌握内标对比法的测定步骤和结果计算方法。

掌握样品、流动相的处理方法，掌握液相色谱仪维护基本知识。二、实验原理

内标对比法是内标法的一种，是高效液相色谱法中最常用的定量分析方法之一。分别配制含有等量内标物的对照品溶液和试样溶液，经HPLC分析后，测得上述两溶液中待测组分(i)和内标物(is)的峰面积，按下式计算试样溶液中待测组分的浓度

对乙酰氨基酚（扑热息痛，PCM）为苯胺类解热镇痛药，是治疗发热、镇痛的首选药物之一。对乙酰氨基酚稀碱溶液在波长257nm附近有最大吸收，可以用于定量测定。在其生产过程中，有可能引入对氨基酚等中间体，这些杂质在上述波长处也有紫外吸收，若采用紫外分光光度法测定含量，方法影响因素较多。为避免杂质干扰，本实验采用HPLC内标对比法测定对乙酰氨基酚含量。

三、主要仪器和试剂

仪器

高效液相色谱仪；C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；电子天平；容量瓶；移液管。

试剂

对乙酰氨基酚对照品：非那西丁对照品；对乙酰氨基酚原料药；甲醇(色谱纯）；重蒸馏水；针头滤器（0.45μm，有机系)。

四、操作步骤

色谱条件

色谱柱：C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：甲醇-水(60：40）；流速：0.6mL/min；检测波长：257nm；柱温：室温；进样量：20μL。

内标溶液的配制

W(％)=×精密称取非那西丁对照品约0.2500g，用适量甲醇溶解后加入100mL

W(％)=

×

对照品溶液的配制

精密称取对乙酰氨基酚对照品约0.0050g，用适量甲醇溶解后加入100mL容量瓶中，再精密加入内标溶液10.00mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取1.00mL，置50mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀即得。4．试样溶液的配制

精密称取对乙酰氨基酚样品约0.0050g，用适量甲醇溶解后加入100mL容量瓶中，再精密加入内标溶液10.00mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取

1.00mL，置50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。

进样分析

对乙酰氨基酚对照品溶液经0.45μm滤膜滤过。用微量注射器吸取滤液，过进样20μL。记录色谱图，重复3次。以同样方法分析试样溶液。

五、数据记录与处理

按下表记录峰面积，按下式计算对乙酰氨基酚的百分含量。

i式中m 是对照溶液中组分i的量。

i

对照

对照品溶液

对照品溶液

试样溶液

序号

Ai

Ais

Ai/Ais

Ai

Ais

Ai/Ais

1

2

3

平均值

六、注意事项

流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；水相流动相需经常更换(一般不超过2天)，防止滋生细菌变质。

实验中可通过选择适当长度的色谱柱，调整流动相中甲醇和水的比例或流

速，使对乙酰氨基酚与内标物的分离度达到定量分析的要求。

内标对比法是内标校正曲线法的应用。若已知校正曲线通过原点，并在一定线性范围内，则可用内标对比法测定。该法只需配制一种与待测组分浓度接近的对照品溶液，并在对照品溶液与试液中加入等量内标（可不必知道内标物的准确加入量），即可在相同条件下进行测定。

七、问题与讨论

比较外标法与内标法、内标对比法定量的优缺点。

如何选择内标物质以及内标物的加入量？

实验中试样溶液和对照品溶液中的内标物浓度是否必须相同？为什

么？