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SET/TAF-Iβ和CHMP6的克隆、表达、纯化以及初步晶体学分析的开题报告
开题报告
一、研究背景
SET/TAF-Iβ是一种在基因表达调控和表观遗传作用中发挥重要作用的蛋白质。它参与细胞周期调控、DNA修复、细胞凋亡等多种生物学过程，也与多种疾病的发生发展有关，如肿瘤、神经退行性疾病等。SET/TAF-Iβ通常以异源二聚体的形式存在，其中C-terminaldomain(CTD)和N-terminaldomain(NTD)各自含有一个核苷酸结合结构域，需要通过相互作用形成二聚体来承担多种生物学功能。在SET/TAF-Iβ结构中，CTD的核苷酸结合结构域与CHMP6蛋白的C端结构域有非常相似的结构，因此成为此项研究的关键蛋白之一。
CHMP6是一种质体膜融合和病毒释放过程中所必需的构成物之一，具有优柔粘性活性，通过与其他蛋白质组装形成聚合物，以促进多种细胞过程的进行。之前的研究已经表明SET/TAF-Iβ和CHMP6之间存在结构上的相似性，但是对于二者相互作用及其作用机制的研究现在还缺乏结构层面的了解。
因此，本研究旨在通过克隆并表达SET/TAF-Iβ和CHMP6的蛋白，采用蛋白纯化方法从大肠杆菌中获取纯度较高的蛋白，并进行初步晶体学分析，以进一步了解SET/TAF-Iβ和CHMP6在结构层面上的相互作用。
二、研究内容与方法
1.蛋白克隆与表达
在本研究中，将采用PCR方法获得SET/TAF-Iβ和CHMP6的蛋白编码序列，将其克隆至pET28a-Tev和pET28a-SUMO表达载体中。然后，将两种表达载体转化至大肠杆菌中，利用SDS和Westernblot等方法进行表达量和纯度的检测、筛选和优化。
2.蛋白纯化
利用Ni-NTA亲和层析、IonExchange层析等几种纯化方法，我们可以从大肠杆菌的细胞裂解液中筛选出含有目标蛋白的纯度较高的部分，并经过再次筛选和精细处理后获得所需的纯度极高的蛋白样品。
3.初步晶体学分析
获取高纯度的SET/TAF-Iβ和CHMP6样品后，将采用蒸发法等方法得到二者的单晶X射线衍射图谱，并通过晶体学分析获取其三维结构，以探究其相互作用的原理和机制。
三、研究意义与创新性
1.深入探究SET/TAF-Iβ和CHMP6之间的相互作用机制，有助于揭示这两个蛋白在细胞中的重要功能，并且对有关疾病的治疗和药物研发也具有一定的参考价值。
2.通过将SET/TAF-Iβ和CHMP6的结构进行比对，我们可以更加深入地理解其异源二聚体的形成原理及其相互作用模式，从而进一步推进相关研究领域的发展。
3.本研究在蛋白纯化和晶体学分析方面，也具有较强的方法学探索和创新性，对于蛋白结构研究也有所贡献。
四、预期成果
1.成功克隆和表达SET/TAF-Iβ和CHMP6的蛋白；
2.通过蛋白纯化方法获得高纯度的SET/TAF-Iβ和CHMP6样品；
3.获得SET/TAF-Iβ和CHMP6的单晶X射线衍射图谱，解析其三维结构，深入理解其相互作用机制。
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