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ELISA实验汇报人：AA2024-01-18

目录实验原理与步骤抗原抗体反应及优化酶标记物选择与使用显色系统建立及优化数据处理与分析方法实验注意事项及故障排除

01实验原理与步骤

ELISA实验基于抗原与抗体之间的特异性结合反应。抗原通常是蛋白质或多肽，而抗体是由免疫系统产生的针对特定抗原的蛋白质。抗原抗体反应在ELISA实验中，抗体被标记上酶，通常是辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。当酶标记的抗体与固相载体上的抗原结合时，酶可以催化底物转化为有色产物，从而可以通过比色法检测抗原的存在。酶标记抗体ELISA基本原理

将抗原或抗体包被在固相载体（如微量滴定板）上，形成固相抗原或抗体。包被封闭加样用封闭液封闭固相载体上未结合的位点，以减少非特异性结合。加入待测样本，使其中的抗原或抗体与固相载体上的抗原或抗体结合。030201实验步骤概述

洗去未结合的抗原或抗体，减少背景干扰。洗涤加入酶标记的二抗，与固相载体上的抗原或抗体结合。加酶标抗体洗去未结合的酶标抗体。再次洗涤实验步骤概述

终止加入终止液终止反应。比色用酶标仪测定各孔的吸光度值，根据标准曲线计算待测样本中抗原或抗体的浓度。显色加入底物溶液，酶催化底物转化为有色产物。实验步骤概述

01包被缓冲液用于稀释抗原或抗体，并使其包被在固相载体上。02封闭液用于封闭固相载体上未结合的位点，常用1%BSA或5%脱脂奶粉。03洗涤液用于洗涤固相载体，常用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）。04底物溶液用于酶催化反应，常用TMB（四甲基联苯胺）或OPD（邻苯二胺）等。05终止液用于终止酶催化反应，常用2M硫酸。06标准品和待测样本用于建立标准曲线和测定待测样本中的抗原或抗体浓度。试剂与材料准备

02抗原抗体反应及优化

抗原表面的特定表位与抗体的互补决定区相结合，形成稳定的抗原-抗体复合物。抗原表位与抗体结合亲和力与结合力特异性验证抗原与抗体之间的结合力取决于它们之间的亲和力，高亲和力有助于形成稳定的复合物。通过竞争性抑制实验或交叉反应实验验证抗原抗体结合的特异性。抗原抗体特异性结合

优化反应温度和时间，以确保抗原抗体充分结合并达到平衡。温度与时间调整抗原和抗体的浓度，以获得最佳的结合效果和信号强度。抗原抗体浓度选择适当的缓冲液和pH值，以维持抗原抗体结合的稳定性和特异性。缓冲液与pH值反应条件优化策略

03对照实验设置设置适当的对照实验，以评估交叉反应和干扰因素的影响，并确保实验结果的准确性。01交叉反应预防通过选择高特异性的抗原和抗体，以及使用阻断剂来减少非特异性结合，从而降低交叉反应的可能性。02干扰因素识别识别并排除可能干扰抗原抗体结合的因素，如内源性物质、非特异性吸附等。交叉反应与干扰因素控制

03酶标记物选择与使用

碱性磷酸酶（ALP）在碱性条件下具有高催化活性，适用于磷酸酯类底物，如BCIP/NBT等。β-半乳糖苷酶（β-Gal）适用于乳糖类底物，具有高灵敏度和特异性，但稳定性相对较差。辣根过氧化物酶（HRP）最常用的酶标记物之一，具有高催化活性和稳定性，适用于多种底物，如OPD、TMB等。常用酶标记物类型及特点

滴定法通过滴定不同浓度的酶标记物与已知浓度的抗体或抗原反应，确定最佳酶标记物浓度。比色法利用酶催化底物产生的颜色变化，通过比色确定酶标记物浓度。荧光法利用荧光底物与酶标记物反应产生的荧光信号，通过荧光检测仪确定酶标记物浓度。酶标记物浓度确定方法

酶标记物应储存在低温、干燥、避光的环境中，以保持其活性。储存条件酶标记物在储存过程中会逐渐失活，应定期检测其活性，并在有效期内使用。有效期在实际应用中，应对酶标记物的稳定性进行考察，包括温度、pH值、离子强度等因素的影响。同时，可以通过添加稳定剂等方法提高酶标记物的稳定性。稳定性考察酶活性保持与稳定性考察

04显色系统建立及优化

常用的ELISA显色底物包括TMB（四甲基联苯胺）和OPD（邻苯二胺）等，其中TMB具有高灵敏度和稳定性好的特点，是首选底物。底物类型底物溶液一般由底物、缓冲液和过氧化氢按一定比例混合而成。具体配制方法需根据所选底物和实验要求进行确定。配制方法显色底物选择与配制方法

显色反应的温度对显色效果有很大影响，一般需要在恒温条件下进行。常用的温度控制方法有使用恒温水浴或使用温度控制仪等。温度控制显色反应的时间也需要严格控制，过长或过短的反应时间都会影响显色效果。一般需要在预实验中确定最佳反应时间。时间控制显色反应的酸碱度对显色效果也有很大影响。一般需要在反应前对底物溶液进行酸碱度调节，以保证反应的顺利进行。酸碱度调节显色条件优化策略

显色反应完成后，需要使用酶标仪等仪器对结果进行观察和记录。观察时应注意背景颜色的干扰，以及不同孔之间的颜色差异。需要记录的内容包括每个孔的吸光度值、标