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2024-01-27
大肠杆菌基因表达系统课件
目录
CONTENTS
引言
大肠杆菌基因表达基本原理
构建大肠杆菌基因表达载体方法
转化大肠杆菌及筛选稳定表达菌株
优化大肠杆菌中目标蛋白表达条件
目标蛋白纯化与鉴定技术
总结与展望
01
引言
基因表达系统的定义
基因表达系统是指将外源基因导入到宿主细胞中，通过宿主细胞的转录和翻译机制，实现外源基因的高效表达的系统。
基因表达系统的组成
基因表达系统通常由启动子、终止子、核糖体结合位点、外源基因和宿主细胞等组成。
基因表达系统的类型
根据宿主细胞的不同，基因表达系统可分为原核表达系统和真核表达系统两大类。
大肠杆菌是一种生长速度非常快的细菌，可以在短时间内获得大量的菌体。
大肠杆菌的遗传背景非常清楚，易于进行基因操作和表达调控。
大肠杆菌具有高效的转录和翻译机制，可以实现外源基因的高水平表达。
大肠杆菌培养条件简单，培养基成本低廉，适合大规模生产和应用。
生长速度快
遗传背景清楚
表达水平高
成本低廉
课件目的
本课件旨在介绍大肠杆菌基因表达系统的基本原理、技术方法和应用实例，帮助读者了解和掌握大肠杆菌基因表达系统的相关知识和技术。
课件结构
本课件共分为引言、基本原理、技术方法、应用实例和展望五个部分。其中，引言部分简要介绍基因表达系统的概念和组成；基本原理部分详细介绍大肠杆菌基因表达系统的基本原理和调控机制；技术方法部分介绍大肠杆菌基因表达系统的常用技术方法，包括基因克隆、转化、筛选和表达等；应用实例部分列举了大肠杆菌基因表达系统在生物医药、农业和环保等领域的应用实例；展望部分对大肠杆菌基因表达系统的未来发展趋势进行了展望。
02
大肠杆菌基因表达基本原理
大肠杆菌的DNA复制是一个半保留复制过程，其中DNA双链在复制叉处解开，每条链分别作为模板合成新的互补链。
DNA复制
在转录过程中，RNA聚合酶与DNA模板结合，将DNA上的遗传信息转录成mRNA。转录起始于启动子序列，终止于终止子序列。
转录
mRNA与核糖体结合，通过tRNA将mRNA上的遗传信息翻译成蛋白质。每个tRNA携带特定的氨基酸，根据mRNA上的密码子序列合成多肽链。
多肽链经过折叠和加工，形成具有生物活性的蛋白质。这个过程包括去除信号肽、二硫键形成、糖基化等修饰。
蛋白质合成
翻译
基因调控机制
大肠杆菌基因表达受到多种调控机制的影响，包括转录水平调控（如启动子、抑制子等）、转录后调控（如mRNA稳定性、降解等）和翻译水平调控（如核糖体结合、蛋白质修饰等）。
影响因素
基因表达受到许多内外因素的影响，如环境因子（温度、pH值、营养条件等）、细胞生理状态（生长阶段、代谢状态等）以及遗传背景（基因型、突变等）。这些因素通过影响调控因子的活性或表达水平，进而调节基因的表达。
03
构建大肠杆菌基因表达载体方法
03
多克隆位点设计
在载体上设计多个克隆位点，以便插入不同长度的目的基因片段。
01
选择合适的载体类型
根据实验需求和目的基因特性，选择合适的载体类型，如质粒、噬菌体或病毒载体。
02
确保载体稳定性
选择在大肠杆菌中稳定复制和传代的载体，以确保基因表达的稳定性和持续性。
重组质粒构建
将插入片段与载体进行连接反应，构建重组质粒。
重组质粒鉴定
通过酶切分析、PCR扩增或测序等方法对重组质粒进行鉴定，确保目的基因已正确插入到载体中。
质粒转化与扩增
将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，进行扩增和保存。
04
转化大肠杆菌及筛选稳定表达菌株
VS
从新鲜平板上挑取大肠杆菌单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.4-0.6。将菌液冰浴10分钟，然后4℃、4000rpm离心10分钟收集菌体。用预冷的0.1MCaCl2重悬菌体，再次离心收集菌体，最后用适量预冷的0.1MCaCl2（含15%甘油）重悬菌体，分装成每管100μl，即为感受态细胞。
转化方法
将1-2μl质粒DNA或连接产物加入100μl感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30分钟。然后42℃热激90秒，迅速放回冰浴中冷却2分钟。加入800μlLB液体培养基，37℃振荡培养1小时。最后将菌液涂布于含相应抗生素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
感受态细胞制备
菌落PCR筛选
01
挑取单菌落进行菌落PCR扩增，通过凝胶电泳检测扩增产物大小是否与预期相符。
抗性筛选
02
利用质粒携带的抗性基因进行筛选，例如氨苄青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。将转化后的菌液涂布于含相应抗生素的LB平板上，能够生长的菌落即为阳性克隆。
荧光筛选
03
对于表达荧光蛋白的质粒，可以在荧光显微镜下直接观察菌落是否发出荧光来判断是否为阳性克隆。
表达水平鉴定
通过Westernblot或ELISA等方法检测
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