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分子生物学基因克隆及克隆基因的表达汇报人：AA2024-01-27

基因克隆技术概述基因克隆技术方法克隆基因的表达调控机制克隆基因表达产物检测与分析方法目录CONTENT

基因克隆技术在医学领域应用实例基因克隆技术挑战与未来发展趋势目录CONTENT

基因克隆技术概述01

基因克隆定义基因克隆（GeneCloning）是指利用分子生物学技术，在体外将特定基因片段与载体DNA连接，然后导入受体细胞，使该基因在受体细胞中复制、扩增并表达的过程。基因克隆原理基因克隆基于DNA重组技术，通过限制性内切酶切割目的基因和载体DNA，再利用连接酶将二者连接形成重组DNA分子。重组DNA分子转化入受体细胞后，可随细胞复制而扩增，实现基因的克隆。基因克隆定义与原理

20世纪70年代初期，科学家们利用限制性内切酶和连接酶，成功实现了DNA片段的连接和克隆。早期基因克隆技术随着研究的深入，出现了多种类型的克隆载体，如质粒、噬菌体、病毒载体等，为基因克隆提供了更多选择。载体的发展20世纪80年代，PCR技术的出现使得特定基因片段的扩增变得简单、快速且高效。PCR技术的出现基因克隆技术发展历程

基础研究基因工程基因治疗生物技术产业基因克隆技术应用领域用于基因结构、功能和表达调控等基础研究。通过克隆和表达特定基因，治疗遗传性疾病或癌症等疾病。在农业、工业、医药等领域，通过基因克隆技术改良生物性状或生产有用物质。应用于生物制药、生物农药、生物燃料等生物技术产业的生产过程。

基因克隆技术方法02

限制性内切酶法选择合适的限制性内切酶根据目标DNA序列的特点，选择能够特异性切割该序列的限制性内切酶。DNA的酶切处理将目标DNA与限制性内切酶混合，在适宜的温度和pH条件下进行酶切反应，得到具有黏性末端的DNA片段。黏性末端连接将具有相同黏性末端的DNA片段进行连接，形成重组DNA分子。

根据目标DNA序列的特点，设计一对特异性引物，用于扩增目标DNA片段。设计引物PCR扩增克隆载体构建将引物、目标DNA、dNTPs、DNA聚合酶等混合，在PCR仪上进行扩增反应，得到大量的目标DNA片段。将扩增得到的目标DNA片段与克隆载体进行连接，构建重组克隆载体。030201聚合酶链式反应法

123将需要连接的两个DNA片段进行酶切处理，得到具有平末端或黏性末端的DNA片段。DNA片段准备将两个具有相同末端的DNA片段与连接酶混合，在适宜的温度和pH条件下进行连接反应，形成重组DNA分子。连接反应将连接产物转化至感受态细胞中，通过筛选得到含有重组DNA分子的阳性克隆。转化与筛选连接酶法

选择合适的宿主菌，制备成感受态细胞，用于接受外源DNA。感受态细胞制备将重组DNA分子或连接产物与感受态细胞混合，在适宜的条件下进行转化反应，使外源DNA进入宿主菌中。转化反应通过抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选等方法，筛选出含有重组DNA分子的阳性克隆。阳性克隆筛选转化与筛选方法

克隆基因的表达调控机制03

转录因子启动子是RNA聚合酶结合的位点，而增强子则能增强启动子的活性，共同调控基因转录的起始和效率。启动子与增强子表观遗传学修饰如DNA甲基化、组蛋白修饰等，通过改变染色质结构，影响转录因子与DNA的结合，从而调控基因转录。通过与DNA特定序列结合，激活或抑制RNA聚合酶的活性，从而调控基因转录。转录水平调控机制

与核糖体结合，协助mRNA与核糖体的识别和结合，促进翻译的起始。翻译起始因子参与肽链的延长过程，确保翻译的准确性和效率。翻译延长因子通过与mRNA的3端非编码区结合，抑制mRNA的翻译或促进其降解，从而调控基因表达。microRNA翻译水平调控机制

通过改变蛋白质的电荷和构象，影响其活性和功能。磷酸化与去磷酸化糖基化能增加蛋白质的稳定性和溶解度，去糖基化则相反。糖基化与去糖基化乙酰化能中和蛋白质的正电荷，改变其与其他分子的相互作用，从而影响其功能。去乙酰化则恢复蛋白质的原始状态。乙酰化与去乙酰化泛素化能标记蛋白质进行降解，去泛素化则相反，共同调控蛋白质的稳定性和功能。泛素化与去泛素化蛋白质修饰与功能多样性

克隆基因表达产物检测与分析方法04

原理蛋白质印迹法（WesternBlot）是一种将蛋白质从混合物中分离并转移到固相支持物上，然后利用特异性抗体进行检测的方法。通过这种方法可以检测克隆基因在细胞中的表达产物，即特定蛋白质。步骤蛋白质提取、电泳分离、转膜、封闭、抗体孵育、显色等。优点灵敏度高，可以检测低丰度蛋白质；特异性强，可以区分同源性较高的蛋白质。蛋白质印迹法检测表达产物

原理01酶活性测定法是通过检测酶催化底物反应的速率来评估酶的功能。对于克隆基因表达的酶类蛋白质，可以通过酶活性测定法来评估其功能和活性。方法02选择合适的底物和反应条件，通过比色法、荧光法等方法检