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ELISA方法详细过程及步骤

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)

的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技

术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许

多领域。

(一)原理

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高

效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一

种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过

洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，

通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用

于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法

等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

(二)操作步骤

方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～

10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，

用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵

育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)

0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃

10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，

阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。

也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以

空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳

性。

方法二用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，

每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。

↓

加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔

中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)

↓

于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，

37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。

↓

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

(三)试剂器材

1.试剂

(1)包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液):

NaCO３1.59克

NaHCO３2.93克

加蒸馏水至1000ml

(2)洗涤缓冲液(PH7.4PBS)：0.15M

KH2PO40.2克

Na2HPO４·12H2O2.9克

NaCl8.0克

KCl0.2克

Tween-200.05％0.5ml

加蒸馏水至1000ml

(3)稀释液：

牛血清白蛋白(BSA)0.1克

加洗涤缓冲液至