动物细胞融合与单克隆抗体技术.pptVIP

3.细胞融合技术：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命K?hler和Milstein,19751984年Nobel医学奖第30页，课件共56页，创作于2023年2月4.HAT选择性培养基的筛选融合后细胞混合液HAT培养基2weekslaterHT培养基正常培养基1weeklater第31页，课件共56页，创作于2023年2月杂交瘤细胞的筛选：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/?脾细胞骨髓瘤细胞/?骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活第32页，课件共56页，创作于2023年2月5.阳性杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）常用方法：要求：简便、快速、敏感;在短时间内能检测大量样品酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)间接免疫荧光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)双相扩散法第33页，课件共56页，创作于2023年2月酶联免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤培养上清液底物有色产物酶标仪检测技术原理：第34页，课件共56页，创作于2023年2月6.杂交瘤细胞的克隆培养常用克隆化方法：有限稀释法软琼脂平板法显微操作法1个细胞/96孔饲养细胞(feedercells)ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。第35页，课件共56页，创作于2023年2月7.杂交瘤细胞的冻存与复苏目的：保种方法：离心收集杂交瘤细胞悬液，用含10％DMSO和10％FBS的培养基调整细胞密度，若短期保存，可置-80度冰盒中；若长期保存，则从冰盒转入液氮中。复苏：如果冻存的细胞是来自96孔板的一孔，复苏后也应接种到96孔板的一个孔中第36页，课件共56页，创作于2023年2月8.单克隆抗体的规模化生产主要有两种方法（1）体外法：用人工反应器大量培养杂交瘤细胞（2）体内法：用生物体作为细胞反应器大规模培养杂交瘤细胞第37页，课件共56页，创作于2023年2月转瓶培养第38页，课件共56页，创作于2023年2月微载体培养第39页，课件共56页，创作于2023年2月9.融合后杂交瘤不生长的原因分析：聚乙二醇有毒小牛血清的质量有问题；支原体污染HAT有问题第40页，课件共56页，创作于2023年2月关于动物细胞融合与单克隆抗体技术第1页，课件共56页，创作于2023年2月5.1细胞融合与杂交第2页，课件共56页，创作于2023年2月一、概念细胞融合：两个或两个以上相同的细胞合并形成一个细胞的过程。细胞杂交：两个或两个以上不同的细胞合并形成一个细胞的过程，包括种内杂交和种间杂交。第3页，课件共56页，创作于2023年2月二、原理异核体阶段杂种细胞形成同核体异核体合核体关键是膜的融合：两个亲本细胞并列，细胞膜接触膜组织局部破坏形成包围融合细胞的连续胞膜第4页，课件共56页，创作于2023年2月细胞融合过程可分为：凝集：细胞凝集与细胞膜的糖蛋白有关蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提脂质分子重排：是实现细胞融合的关键胞质合并：后续的稳定步骤。第5页，课件共56页，创作于2023年2月1.病毒介导融合：（1）诱导原理三、细胞融合方法（2）操作步骤(3)病毒诱导融合的特点第6页，课件共56页，创作于2023年2月2.化学融合剂诱导融合（P107）（1）化学融合剂的种类三、细胞融合方法（2）PEG诱导的原理

（3）PEG诱导的特点sp3杂化，有孤对电子，可与H2O形成H键而具有强烈的吸水性。第7页，课件共56页，创作于2023年2月3.电融合技术 三、细胞融合方法第8页，课件共56页，创作于2023年2月电融合的特点①融合频率高，对细胞伤害小②正弦交变电场对细胞的长时间作用会损伤细胞③非特异性融合三、细胞融合方法磁-电融合声-电融合电-机械融合细胞化学聚集融合生物素-抗生物素-抗原-抗体桥联第9页，课件共56页，创作于2023年2月4.激光诱导细胞融合（1）原理：光镊所形成的光学势阱会把细胞拉向光束中心，钳住细胞，从而实现了对生物粒子的远