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过氧化物酶（POD）活性测定
【实验原理】
过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H0存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐
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色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中]
【方法步骤】
、粗酶液的提取称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO42.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO42.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
、酶活性的测定取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反
应混合液3mL，稀释后的酶液1mL（如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次（4min）。以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。
管 号S0（对照）
管 号
S0（对照）
S1（实验）
S2（实验）
反应混合液(ml)
3.0
3.0
3.0
KH2PO4(ml)
1.0
0.0
0.0
酶液(ml)
0.0
1.0
1.0
4.结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min·g（鲜重）]表示之。也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u）表示。
?A ?V
470 T
POD总活性[u/g(FW)]=
0.01?V?t?FW
1
式中：POD总活性以酶单位每克鲜重表示。其中△470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK——照光对照管的吸光度。AE——样品管的吸光度。
Vt——样品液总体积，mL。
V1——测定时样品用量，mL。W——样品鲜重，g。
蛋白质含量单位为mg/g。
过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
【原理】
HO在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A )随反应时间而降低。根据
22 240
测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【试剂】
mol/LpH7.8磷酸缓冲液：取A液91.5ml，B液8.5ml,充分混合。
0.1mol/LHO 以30%的过氧化氢稀释(30*1.1g/34.01)mol/100ml=9.7mol/L,取0.52ml30%的过氧化氢稀释到50ml.
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【方法】
酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2ml4℃下预冷的pH7.8磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，再用缓冲液冲洗研钵数次定容至25ml，合并冲洗液，混合均匀后置于5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。
测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2顺序加入试剂。
表2 紫外吸收法测定HO样品液配置表
管 号S0（对照）S1（实验）S2（实验）
管 号
S0（对照）
S1（实验）
S2（实验）
粗酶液(ml)
0.2（煮死）
0.2
0.2
pH7.8磷酸(ml)
1.5
1.5
1.5
蒸馏水(ml)
1.0
1.0
1.0
煮死酶在沸水浴中煮沸5min.30℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的HO，每加完一管立即记时，并迅速倒入
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石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。3.结果计算：
以1min内A 减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。
240
?A240?VT
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=0.1?V1?t?FW
式中：POD总活性以酶单位每克鲜重表示。其中△470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK——照光对照管的吸光度。AE——样品管的吸光度。
Vt——样品液总体积，mL。
V1——测定时样品用量，mL。W——样品鲜重，g。
蛋白质含量单位为mg/g。
所需试剂的配制
A液：0.2mol/LNa2H
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